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龙图腾网恭喜深圳市茵冠生物科技有限公司申请的专利一种人蜕膜间充质干细胞培养方法及其应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN119060949B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-03-18发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202411567186.9，技术领域涉及：C12N5/0775；该发明授权一种人蜕膜间充质干细胞培养方法及其应用是由汪江浩;江颖纯;郭爱红;姜舒;赵传鑫;谢亮;张芸;谢元进;李欣;莫喜婷;邹沛华;吴艳设计研发完成，并于2024-11-05向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种人蜕膜间充质干细胞培养方法及其应用在说明书摘要公布了：本发明涉及一种人蜕膜间充质干细胞培养方法及其应用，属于干细胞技术领域。所述培养方法为清洗分离、组织处理、蜕膜层的分离和处理、进行两次消化、接种培养、换液传代、终止消化、冻存储存。本发明提供一种合适的酶浓度及酶组合隔夜消化人蜕膜组织，通过二次消化方式处理人蜕膜组织，再利用特殊培养基进行培养，取消了震荡摇床的使用，不仅能有效分解组织促进干细胞释放，缩短培养周期，减少细胞损伤提高存活率和活性，而且培养基无异源成分、操作方便、成本较低，可满足细胞治疗及临床有关的应用需求。

本发明授权一种人蜕膜间充质干细胞培养方法及其应用在权利要求书中公布了：1.一种人蜕膜间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述培养方法为清洗分离、组织处理、蜕膜层的分离和处理、进行两次消化、接种培养、换液传代、终止消化、冻存储存；所述进行两次消化即离心后取2mL组织沉淀加入18mL特殊培养基中，再加入终浓度为1.0gL的ǁ型胶原酶和终浓度为0.2gL的中性蛋白酶得到组织悬液，将组织悬液加入T175培养瓶中置于培养箱中隔夜消化20h后，再加入终浓度为0.5gL的重组酶，消化10min，得到组织消化悬液；所述清洗分离即将胎盘先后用0.9%生理盐水、三抗清洗3遍后分离，分离后放入装有35ml生理盐水的90mm培养皿中，用无菌镊子去除粘连在组织上的血渍；所述组织处理即用无菌手术剪将组织分离成3.5cm2大小的组织片，平铺放入装有含1%三抗的90mm培养皿中，静置灭菌5min；所述蜕膜层的分离和处理即用生理盐水清洗3遍组织片后分离蜕膜层，将分离好的蜕膜层，放入装有含1%三抗的90mm培养皿中，静置灭菌5min，再用生理盐水清洗3遍蜕膜层组织，用新的无菌剪刀将组织剪至2mm3大小的组织碎，以500g离心10min；所述接种培养即将组织消化悬液于500g下离心10min后去上清，在T175培养瓶中加入2mL细胞组织悬液、18mL特殊培养基、终浓度为100UmL的青霉素、终浓度为100UmL的链霉素和终浓度为100UmL的两性霉素B，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，得到P0代；所述换液传代即于培养第2天、第5天时全量换液，至培养第9天时观察细胞融合度达到80%，去上清，用0.9%生理盐水清洗1遍后，用0.125%胰酶消化3.5min，用特殊培养基终止消化，再用100μm滤网过滤，获得细胞消化悬液，计数后于300g离心10min，用特殊培养基重悬细胞悬液后用T175培养瓶培养，得到P1代；所述终止消化即在培养第十二天时观察细胞融合度达到80%，去上清，用0.9%生理盐水清洗1遍后，用0.125%胰酶消化3.5min，用特殊培养基终止消化，获得细胞消化悬液，计数后于300g离心10min；所述冻存储存中的冻存液由DMSO、人血白蛋白、特殊培养基按照质量比1:1:8组成，所述冻存密度为6.5×106cellsml；所述特殊培养基以DMEM高糖型培养基作为基底，添加10%血小板裂解液、340ngml纤维连接蛋白、20gL血清白蛋白、20ngmL人碱性成纤维生长因子、4mmol的L-谷氨酰胺、1.0×107cellsmL人脐带间充质干细胞裂解液；所述人脐带间充质干细胞裂解液的制备方法为，准备水浴锅，设置温度为37℃；准备液氮，反复冻融4次，于1500g离心10min，取上清，得到人脐带间充质干细胞裂解液。

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