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龙图腾网恭喜齐鲁工业大学(山东省科学院)申请的专利一种异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN115786223B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-04-25发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202211486340.0，技术领域涉及：C12N1/21；该发明授权一种异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用是由王腾飞;王相懿;刘洪玲;蒋艺;袁海波;黄迪;孟武设计研发完成，并于2022-11-24向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用在说明书摘要公布了：本发明涉及一种异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明采用枯草芽孢杆菌多位点基因组整合的方式，构建amyE、lacA、lipA、eglS四位点整合型重组菌株，可有效提高麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase在枯草芽孢杆菌中的表达，同时实现麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase在枯草芽孢杆菌中的同源异体表达，并进行双酶转化法生产海藻糖。

本发明授权一种异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法及应用在权利要求书中公布了：1.一种异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、构建枯草芽孢杆菌amyE位点整合质粒pDG-amyE-P43-MTSase-amyE，包括如下步骤：（1）以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增组成型启动子P43基因片段；（2）以嗜酸热硫化叶菌SulfolobusacidocaldariusATCC33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段；（3）以pDG1730质粒为模板，反向PCR扩增获得pDGamyE线性化载体基因片段；（4）利用无缝克隆技术，分别将步骤（1）中的启动子P43基因片段、步骤（2）中的麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段、步骤（3）中的pDGamyE线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌amyE位点整合质粒pDG-amyE-P43-MTSase-amyE；步骤2、构建枯草芽孢杆菌lacA位点整合质粒pDG-lacA-P43-MTSase-Cm-lacA，包括如下步骤：①以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增lacA上游同源臂基因片段；②以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增lacA下游同源臂基因片段；③以pDG-amyE-P43-MTSase-amyE质粒为模板，PCR扩增P43-MTSase基因片段；④以pHT01质粒为模板，PCR扩增获得氯霉素Cm抗性基因片段；⑤以pDG1730质粒为模板，反向PCR扩增获得pDGlacA线性化载体基因片段；⑥利用无缝克隆技术，分别将步骤①中的lacA上游同源臂基因片段、步骤③中的P43-MTSase基因片段、步骤④中的氯霉素Cm抗性基因片段、步骤②中的lacA下游同源臂基因片段、步骤⑤中的pDGlacA线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌lacA位点整合质粒pDG-lacA-P43-MTSase-Cm-lacA；步骤3、构建枯草芽孢杆菌lipA位点整合质粒pDG-lipA-P43-MTSase-Em-lipA，包括如下步骤：[1]以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增lipA上游同源臂基因片段；[2]以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增lipA下游同源臂基因片段；[3]以pDG-lacA-P43-MTSase-Cm-lacA质粒为模板，PCR扩增P43-MTSase基因片段；[4]以pMAD质粒为模板，PCR扩增获得红霉素Em抗性基因片段；[5]以pDG1730质粒为模板，反向PCR扩增获得pDGlipA线性化载体基因片段；[6]利用无缝克隆技术，分别将步骤[1]中的lipA上游同源臂基因片段、步骤[3]中P43-MTSase基因片段、步骤[4]中的红霉素Em抗性基因片段、步骤[2]中的lipA下游同源臂基因片段、步骤[5]中的pDGlipA线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌lipA位点整合质粒pDG-lipA-P43-MTSase-Em-lipA；步骤4、构建枯草芽孢杆菌eglS位点整合质粒pDG-eglS-P43-MTHase-Km-eglS，包括如下步骤：A以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增eglS上游同源臂基因片段；B以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增eglS下游同源臂基因片段；C以pHT01-P43-MTHase质粒为模板，PCR扩增P43-MTHase基因片段；D以pMA5质粒为模板，PCR扩增获得卡那霉素Km抗性基因片段；E以pDG1730质粒为模板，反向PCR扩增获得pDGeglS线性化载体基因片段；F利用无缝克隆技术，分别将步骤A中的eglS上游同源臂基因片段、步骤C中的P43-MTHase基因片段、步骤D中的卡那霉素Km抗性基因片段、步骤B中的eglS下游同源臂基因片段、步骤E中的pDGeglS线性化载体基因片段连接在一起，获得枯草芽孢杆菌eglS位点整合质粒pDG-eglS-P43-MTHase-Km-eglS；步骤5、构建枯草芽孢杆菌amyE单位点整合菌株BacillussubtilisamyE::P43-MTSase：将步骤1构建的pDG-amyE-P43-MTSase-amyE质粒转化进B.subtilisWB800N中，制得amyE单位点整合菌株B.subtilisWB800namyE::P43-MTSase；步骤6、构建枯草芽孢杆菌amyE和lacA双位点整合菌株BacillussubtilisamyE::P43-MTSaselacA::P43-MTSase：将步骤2构建的pDG-lacA-P43-MTSase-Cm-lacA质粒转化进B.subtilisWB800namyE::P43-MTSase中，制得amyE、lacA双位点整合菌株B.subtilisWB800namyE::P43-MTSaselacA::P43-MTSase；步骤7、构建枯草芽孢杆菌amyE、lacA和lipA三位点整合菌株BacillussubtilisamyE::P43-MTSaselacA::P43-MTSaselipA::P43-MTSase：将步骤3构建pDG-lipA-P43-MTSase-Em-lipA质粒转化进B.subtilisWB800namyE::P43-MTSaselacA::P43-MTSase中，制得amyE、lacA、lipA三位点整合菌株B.subtilisWB800namyE::P43-MTSaselacA::P43-MTSaselipA::P43-MTSase；步骤8、构建枯草芽孢杆菌amyE、lacA、lipA和eglS四位点整合菌株BacillussubtilisamyE::P43-MTSaselacA::P43-MTSaselipA::P43-MTSaseeglS::P43-MTHase：将步骤4构建的pDG-eglS-P43-MTHase-Km-eglS质粒转化进B.subtilisWB800namyE::P43-MTSaselacA::P43-MTSaselipA::P43-MTSase中，制得amyE、lacA、lipA、eglS四位点整合菌株B.subtilisWB800namyE::P43-MTSaselacA::P43-MTSaselipA::P43-MTSaseeglS::P43-MTHase，即异源同体表达MTSase和MTHase重组枯草芽孢杆菌。

如需购买、转让、实施、许可或投资类似专利技术，可联系本专利的申请人或专利权人齐鲁工业大学(山东省科学院)，其通讯地址为：250300 山东省济南市长清区大学路3501号；或者联系龙图腾网官方客服，联系龙图腾网可拨打电话0551-65771310或微信搜索“龙图腾网”。