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申请/专利权人：南京农业大学

摘要：本发明公开了水稻基因ORYsa；LPR5的基因工程应用。包括该基因在提高土壤中磷素吸收利用效率方面和增强对土壤中磷养分水平的感知能力的应用。水稻多铜氧化酶基因ORYsa；LPR5的cDNA序列SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列SEQ ID NO.2。本发明基因为单子叶植物中的首次报道，在提高土壤中磷素吸收利用效率方面起着重要作用。ORYsa；LPR5作为目的基因导入植物，其超量表达可提高磷吸收总量近两倍，且提高了水稻根系对磷的吸收速率，提高植物耐低磷能力，为培育适用于磷贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。ORYsa；LPR5的超量表达影响了正常供磷水平下水稻根系的发育，促进了水稻种子根、不定根的发育。

主权项：水稻多铜氧化酶基因ORYsa；LPR5在提高水稻磷素吸收利用中的应用，所述的水稻多铜氧化酶基因ORYsa；LPR5基因在Genbank的登录号为Os01g0127200。

全文数据：水稻基因ORYsa;LPR5的基因工程应用技术领域[0001]本发明涉及植物基因工程技术领域，涉及水稻基因ORYsa;LPR5的基因工程应用。背景技术[0002]水稻是我国主要的粮食作物之一，我国水稻种植面积占全球谷类作物种植面积的13,水稻产量占全国粮食总产的50%，是保证我国粮食安全的最重要作物（胡培松等，2002〇[0003]磷是植物生长发育所必需的三大营养元素之一。它不仅涉及到生物膜及核酸的合成，同时在能量代谢和酶的调控上扮演重要的角色。由于磷素P〇43-、HP042-、H2P04_在酸性与碱性土壤中的强烈固定作用，使得饱和的土壤溶液中可溶性磷的含量很低小于IOyMBieleski,R.L.Phosphatepools，phosphatetransportandphosphateavailability.Annu.Rev.PlantPhysiol·1973,24,225-252，远远满足不了植物的生长需要，使其成为植物生长的一大限制性因子。因此植物能否高效利用土壤中少量的可溶性磷对植物生长有着至关重要的影响。[0004]另外，植物体的生长过程分为营养生长和繁殖生长两个时期。营养生长时期，根系吸收的氮、磷除了满足自身各种生命活动的需要，在液泡中积累形成库;繁殖生长时期，在叶片、茎杆中积累的磷向繁殖器官转移，形成新的源和库Marschner，1995。磷元素在体内的再分配受严格的时空调控，而且随着人们生活水平的提高，稻米的营养品质日益受到关注。研究如何改良磷生长后期向籽粒中的转运与再分配对于改善稻米品质具有重要意义。[0005]在之前的研究中，拟南芥中的编码多铜氧化酶的基因AtLPR1和它的同源基因AtLPR2参与到缺磷条件下种子根发育及对环境中磷的感受机制。水稻作为单子叶模式植物与双子叶模式植物拟南芥在根系发育，磷的响应机制都有许多不同。我们通过在多个基因组数据库中的检索比对，确定了水稻中的5个LPR基因，OsLPRl-5。本发明对其中的LPR5进行了较详尽的研究，LPR5与拟南芥AtLPRlAtLPR2氨基酸序列的一致性分别为45.1%44.8%。虽然〇81^1?5,4让?1?12都与植物磷素营养调控网络中发挥重要左右，但是两者在功能上的区别是显而易见的。拟南芥中的AtLPRl2导致影响了植株主根根系伸长，减少了根系细胞间隙间铁的积累，缓解了拟南芥根系在缺磷情况下根系发育受阻的症状。水稻中，我们过量表达了0sLPR5基因，水稻主根和不定根的根长均变长。除了根系的变化之外，水稻中过量表达0sLPR5还显著提高了根系对磷酸盐的吸收，植物体内磷的的积累。而LPR基因表达量的变化影响植物对磷吸收、利用效率的提高在拟南芥的研究中并未涉及。发明内容[0006]本发明的目的在于提供水稻多铜氧化酶基因〇RYsa;LPR5的基因工程应用，该基因在水稻中超表达提高水稻磷素吸收利用和促进水稻根系发育。[0007]技术方案[0008]本发明提供了水稻多铜氧化酶基因ORYsa;LPR5的基因工程应用，其基因序列登录号为0s01g0127200,基因序列全长3370bp，包括3个外显子和2个内含子。cDNA序列为SEQIDNO.1，全长2485bp，其编码蛋白氨基酸序列为SEQIDNO.2,共637个氨基酸。以NCBI网站获取的基因全序列转化水稻，使其超量表达。[0009]将获得的纯合体株系进行水培实验，测定苗期不同部位总磷浓度，水稻种子根和不定根的长度等生理指标。[0010]将获得的纯合体株系进行盆栽实验，测定于成熟期分部位采样，测定各部位磷浓度差异。采样部位包括:倒一叶、倒二叶、茎、穗杆、穗柄、瘪壳、种壳、种子。[0011]上述基因〇RYsa;LPR5的基因工程应用，是指在提高水稻磷素吸收利用和促进水稻根系发育。[0012]有益效果[0013]本发明基因0RYsa;LPR5的功能为单子叶植物中的首次报道，在提高土壤中磷素吸收利用效率方面起着重要作用。〇RYsa;LPR5作为目的基因导入植物，其超量表达可提高磷吸收总量近两倍，且提高了水稻根系对磷的吸收速率，提高植物耐低磷能力，促进水稻根系发育作用，为培育适用于磷贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。附图说明[0014]图1:水稻基因ORYsa;LPR5在不同组织部位的表达模式。[0015]图2:水稻基因0RYsa;LPR5在不同缺素条件，不同缺磷时间点的表达模式。[0016]图3:0RYsa;LPR5基因超量表达材料与野生型水稻（日本晴）表型差异及生物量的统计。[0017]图4:正常供磷缺磷条件下，0RYsa;LPR5基因超表达植株的根、茎、老叶和新叶中的有效磷和总磷含量。[0018]其中，WT代表野生型水稻，0x1-4分别代表0RYsa;LPR5超表达株系（图5-8同）。[0019]图5:正常供磷缺磷条件下，ORYsa;LPR5基因超表达植株根系P32吸收速率[0020]图6:正常供磷缺磷条件下，ORYsa;LPR5基因超表达植株的根系表型[0021]图7:正常供磷缺磷条件下，0RYsa;LPR5基因超表达植株的种子根和不定根长度[0022]图8:ORYsa;LPR5基因超表达转基因材料在生长后期全磷含量。[0023]图9pTCK303质粒图谱。具体实施方式[0024]实施例1、基因序列的获得[0025]申请人在NCBI网站www.ncbi.nlm.nih.gov上输入0RYsa;LPR5得到基因序列号为0s01g0127200的一段编码多铜氧化酶基因的DNA序列。分析表明该基因序列全长3370bp，cDNA全长2485bp，开放阅读框ORF为1914bp，编码637个氨基酸。该基因有3个外显子、2个内含子。[0026]实施例2、ORYsa;LPR5基因的表达模式鉴定[0027]2.1、总RNA的提取和转录合成cDNA第一链[0028]选用水稻品种“日本晴”，待水稻幼苗长至10天后，完全营养液培养1周后采样倒一叶，倒二叶，倒四叶，倒二叶叶鞘，倒四叶叶鞘，根茎结合部，根系根尖，根系伸长区和成熟区）。水稻苗龄至30天移栽至盆砵中进行盆栽处理，苗龄60天时进行采样旗叶，倒三叶，旗叶叶鞘，倒三叶叶鞘，杆，茎结和穗柄）。分别采用TriZol试剂抽提总RNA，用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。以获得的总RNA为模版，经过逆转录获得水稻cDNA第一链，供后续的实验使用。cDNA第一链的合成步骤：用DEPC水处理过的PCR管300μ1，加入总RNA5yg，oligodTlyL25ngyL，1阶？（1〇111111〇17〇241^，65°：水浴511^11，迅速置于冰上冷却，加5X反应缓冲液4yL，M-MLV逆转录酶200UyLIyL，RNase抑制剂0.5yL，DEPC水至总体积为20yL以上均在冰上操作）。稍离心后置于42°C水浴Ih，70°C水浴IOmin，然后置于冰上迅速冷却。所得产物即为cDNAs，置于-20°C保存。[0029]2.20RYsa;LPR5基因的组织特异性表达模式鉴定[0030]以步骤2.1获得的“日本晴”cDNA为模板，根据水稻0sLPR5基因的编码序列，设计以下0sLPR5基因特异引物Pl、P2扩增长度为301bp片段长度鉴定ORYsa;0sLPR5基因的表达模式。[0031]PlCGATGAGAATATGAGATGAAGAAGCTSEQIDNO.3[0032]P2CGCACCAGTTTATGACTAGCAAASEQIDNO.4[0033]PCR具体步骤为：以步骤1获得的cDNA为模板，使用ABISt印OnePlus购自ABI生物公司）和SYBRPremixExTaqKit购自TaKaRa公司）进行基因定量PCR分析。根据TaKaRa试剂说明使用20μ1的反应体系：SYBRPremixExTaq10μ1，上下游引物各0.4μ1，cDNA模板2μ1，ROXReferenceDye50x0.4yl，ddH206·8μ1。反应条件为：40个循环，95°Clmin，95°C5s，60°〇308,95°：158,60°：11^11，951€58。定量结果根据2-八^方法计算分析鉴定081^1?5基因的时空表达模式，结果见图1。委托南京金斯瑞生物技术公司测序确定序列为0RYsa;0sLPR5片段。[0034]由图1可以看出，ORYsa;LPR5基因主要在根系和根茎结合部表达。[0035]2.30RYsa;LPR5基因的响应缺磷的表达模式鉴定[0036]选用水稻品种“日本晴”，待水稻幼苗长至10天后，分别进行完全营养液和分别缺氮N，磷⑵，钾K，镁Mg和铁Fe的营养液处理，7日后采集水稻根系。RNA提取、反转录，荧光定量PCR方法同2.1、2.2。用于检测0sLPR5对不同元素缺乏的响应。由图2A可以看出，缺磷营养液显著诱导了0sLPR5基因表达水平的上调，0sLPR5对其他元素的缺乏响应并不敏感。[0037]2.40RYsa;LPR5基因的响应缺磷时间点[0038]选用水稻品种“日本晴”，待水稻幼苗长至10天后，分别进行正常供磷（300μΜΚΗ2Ρ〇4和低磷（10μΜΚΗ2Ρ〇4处理，分别在6小时，1天，2天，7天，21天同时对加磷减磷两种处理取植株样。RNA提取、反转录，荧光定量PCR方法同2.1、2.2。用于检测0sLPR5在不同时间点缺磷条件下表达的变化。如图2B所示0sLPR5在缺磷1天时表达量即有明显上调，与其他同时期处理的已报道的响应磷缺乏的基因相比（结果未展示），响应更加敏感。[0039]实施例3利用Ubi启动子+编码区转基因水稻植株研究0RYsa;0sLPR5的应用前景[0040]3.1超量表达载体的构建[0041]编码区为0RYsa;0sLPR5的编码区。[0042]根据水稻基因0RYsa;0sLPR5的cDNA序列，设计引物扩增0RYsa;0sLPR5的编码区。[0043]以cDNA克隆为模板进行PCR，PCR反应体系为25yl:PCRBuffer2.5yl，dNTPMix2μl，正向和反向引物（SEQIDN0.5和SEQIDN0.6各lμl，模板lμl，DNA聚合酶0.5μl，双蒸水17μ1;程序为：94°C预变性4分钟，94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸211^11。30个循环后，72°C7min，跑胶检测，ORYsa;OsLPR5的PCR产物大小为1626bp，PCR产物克隆至pUC18T载体（Takara公司），测序正确后通过相应的BamhI和KpnI酶切位点导入双元表达载体PTCK303,WangZ1ChenCHB1XuYYJiangRX1HanY,XuZHH1ChongK.Apracticalvectorforefficientknockdownofgeneexpressioninrice.PlantMolecularBiologyReporter.200422:409-417图9，然后转化至农杆菌EHA105天恩泽基因科技有限公司）中。[0044]3.2超量表达转基因植株的获得和功能鉴定[0045]将步骤1获得的转有表达载体的农杆菌，进一步转化至水稻采用根癌农杆菌介导方法将构建的表达载体转入水稻日本晴品种）。诱导水稻成熟胚愈伤。将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟（愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可，不停的摇动）；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；愈伤组织置于共培养基上，28°：暗培养2.5天。然后愈伤转入含25〇1^1羧苄青霉素扣0和5〇11^1潮霉素的选择培养基上进行筛选。挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入装有分化培养基的培养皿或分化罐中，放入恒温培养室分化成苗。再放入生根培养基中壮苗一到两周，即获得转基因植株。[0046]3.3超量表达转基因植株不同磷处理条件下生长状况的影响[0047]对获得的转基因植株进行检测后，取不同株系的ORYsa;0sLPR5超表达转基因植株0RYsa;0sLPR5-0x进行正常供磷300μΜKH2PO4和缺磷（10μΜ条件下培养生长三周，0sLPR5对超量表达材料和野生型进行观察拍照，并对植株地上部和地下部分别测定生物量（鲜重）。如图3所示，正常供磷条件下0sLPR5过量表达材料的地上部鲜重较野生型下降了46%，地下部下降了41%。缺磷培养条件下0sLPR5过量表达材料生物量没有显著变化。[0048]3.4不同磷处理条件下0sLPR5超量表达对水稻磷吸收的影响[0049]对获得的转基因植株进行检测后，取不同株系的ORYsa;0sLPR5超表达转基因植株01^83;〇81^1?5-^进行正常供磷（30^]\11!12?〇4和缺磷（1^]«条件下培养生长三周（同3.3，分别取根、茎、老叶和新叶各0.5g，测定样品的有效磷含量。成熟期分别测定穗柄，穗，籽粒等繁育器官的磷含量。操作步骤如下：⑴取0.5克鲜样用液氮研磨成粉末，在4°C放置冰上或者冰箱至样品冻融，加入Iml10%wv的高氯酸PCA研磨均匀。⑵匀浆液用5%wv的高氯酸PCA稀释10倍，于冰上放置30分钟。⑶于4°C，IOOOOg离心10分钟，上清液用于有效磷含量的测定钼蓝法）。⑷取2ml工作溶液与Iml样品上清液混合，于40°C温育20分钟。5反应液在冰上冷却后，于820nm可见光波长下测定吸收值。如样品浓度过高，应适当稀释，使其OD值落在标线的线性范围内。计算获得各个部位的有效磷含量。实验结果显示根部与野生型相比没有明显差异，地上部分茎、老叶和新叶中有效率含量达到了野生型部位的1.5-2倍，显著提高了磷素的利用效率（图4。同时我们利用P32同位素吸收实验，对0sLPR5超表达材料与野生型水稻对磷酸盐的吸收速率进行比较。实验结果表明，0sLPR5超表达材料吸收磷酸盐的速率比野生型提高了30%-40%图5。[0050]3.50SLPR5超量表达对水稻根系生长的影响[0051]不同株系的0RYsa;0sLPR5超表达转基因植株0RYsa;0sLPR5-0x与野生型，进行正常供磷300μΜKH2PO4和缺磷（10μΜ条件下培养10天，利用刻度尺统计种子根长和不定根根长。并使用LC-4800根系扫描仪对植株根系扫描成像图6，计算分析侧根密度、根毛等根系指标。如图7所示OsLPR5超表达转基因植株种子根长和不定根根长较野生型提高了10%。[0052]3.60sLPR5超量表达对水稻生长后期磷营养再分配的影响[0053]将苗龄至30天的0sLPR5超表达材料与野生型水稻移栽至盆砵中进行盆栽实验，对不同部位（旗叶，叶鞘，杆，穗柄和籽粒等）进行采样杀青。70摄氏度烘干72小时后，使用H2SO4-H2O2消解方法消解。使用钼蓝比色法测定植株各部位的总磷含量。如图8所示0sLPR5超表达材料生长后期体内磷的分配也发生了变化，与野生型相比，茎杆中的全磷含量增加了约30%，其他部位没有显著变化。[0054]综上所述，本发明人提供的ORYsa;0sLPR5的工程应用为水稻中首次报道。ORYsa;0sLPR5可作为目的基因导入植物，提高植物磷素利用效率和吸收速率，为培育高磷素吸收及其体内磷素高效再分配的水稻新品种提供了保障。[0055]为了简单起见，本发明中ORYsa;0sLPR5有时标注为0sLPR5。

权利要求：1.水稻多铜氧化酶基因0s01g0127200在提高水稻磷素吸收利用中的应用。2.水稻多铜氧化酶基因0s01g0127200在改善水稻根系发育中应用。3.水稻多铜氧化酶基因0s01g0127200在开发高磷素吸收及其体内磷素高效再分配的水稻新品种的应用。

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