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申请/专利权人：南京林业大学

摘要：本发明公开了一种美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白及其应用，该美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白表达方法如下：构建pETSUMO-ABP-dHC-CecropinA表达载体，在大肠杆菌中表达，超声破碎后收集上清Ni+亲和纯化，梯度洗脱之后得到美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白。本发明通过基因重组方法获得美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白，并在大肠杆菌中获得高效表达，目的多肽经过HPLC分析达到大95%的纯度，通过质谱分析，分子量与预测多肽分子量也吻合。经检测，多肽具有明显的抗真菌活性，所制备的目的多肽，其活性高、成本低。

主权项：一种美国白蛾SUMO‑ABP‑dHC‑ Cecropin A融合蛋白，其特征在于，由以下步骤获得：1）根据美国白蛾天蚕素A基因序列设计引物A1、A2，以美国白蛾DNA为模板进行PCR，将PCR产物割胶回收，回收产物用Stu1和HindⅢ酶切，SUMO载体只用HindⅢ酶切，T4 DNA Ligase连接酶切后的载体和PCR产物，连接产物转化E.coli top10中，获得含Petsumo‑ABP‑dHC‑ Cecropin A重组菌株；挑选阳性重组菌株，扩大培养提取Petsumo‑ABP‑dHC‑ Cecropin A重组质粒，转化到大肠杆菌BL21；2）IPTG浓度0.2 mmolL，低温诱导含有重组载体pETSUMO‑dHC‑ Cecropin A的大肠杆菌表达菌株BL21，20小时后4℃收菌，冰上超声破碎表达菌体，4℃，13000g，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+‑NTA柱洗去杂蛋白，收集目的多肽透析过滤除菌后保存；其中，美国白蛾天蚕素A基因序列如SEQ ID NO.1所示。

全文数据：—种美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白及其应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白及其应用。背景技术[0002]随着抗生素的大量应用，致病菌耐药性的产生和新生抗生素的筛选瓶颈使得抗生素的应用受到一定的制约。近年来的研宄发现，抗菌肽Antimicrobalpeptides，AMPs以其独特的作用机理和分子特性成为有望替代传统抗生素的理想药物。[0003]要将抗菌肽应用到生产实践，还有许多问题亟待解决，其中最主要的问题就是如何大量获取，现阶段主要通过以下3种途径获得抗菌肽：（1天然提取；（2化学合成；（3基因工程表达。虽然生物提取可为工农业生产提供便宜、安全、可靠的抗菌肽产品，而且最早研宄与发现抗菌肽往往采用生物提取的方法，但由于抗菌肽在动植物体内含量极微，因而天然提取抗菌肽往往杂质较多、提取率较低、费时长、工艺复杂，因此成本相对较高，无法实现大规模生产，这也成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。化学合成的方法虽然在生产上行得通，但是运用于产业化并不现实，特别是费用昂贵、对长链肽合成的低效率和抗菌活性不稳定的问题，使得其应用受到限制，仍不及通过基因工程在体外表达的发展潜力。利用基因工程方法来生产抗菌肽是一条理想途径，通过对基因工程菌种、表达载体、表达条件、分离纯化条件、表达系统等的不断改造与优化，得到了大量不同种类有活性的重组抗菌肽。发明内容[0004]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种美国白蛾SUM0-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白，具有很好的抗菌活性。本发明的另一目的是提供上述美国白蛾SUM0-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白的应用。[0005]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：[0006]一种美国白蛾SUM〇-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白，由以下步骤获得：[0007]1根据美国白蛾天蚕素A基因序列设计引物A1、A2,以美国白蛾DNA为模板进行PCR，将PCR产物割胶回收，回收产物用StW和i酶切，SUM0载体只用ffi酶切，T4DNALigase连接酶切后的载体和PCR产物，连接产物转化£.coiitoplO中，获得含Petsumo-ABP-dHC-CecropinA重组菌株；挑选阳性重组菌株，扩大培养提取Petsum〇-ABP-dHC-CecropinA重组质粒，转化到大肠杆菌BL21;[0008]2IPTG浓度0.2mmolL，低温诱导含有重组载体pETSUM〇-dHC-CecropinA的大肠杆菌表达菌株BL21，20小时后4°C收菌，冰上超声破碎表达菌体，4°C，13000g，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过M+-NTA柱洗去杂蛋白，收集目的多肽透析过滤除菌后保存；[0009]其中，美国白蛾天蚕素A基因序列如SEQIDNO.1所示。[0010]所述的美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白，所述的引物A1、A2序列分别为：[0011]A1序列：5’-CAGGTGGAAGATCTTTMGAAAATCG-3’，[0012]A2序列：5’-CCCAAGCTTTTATTTTCTTMTGCTTTTGC-3’；[0013]其中，A1的5’端具有5加酶切位点，A2的5’端具有酶切位点。[0014]所述的美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白，过Ni+-NTA柱洗去杂蛋白的步骤为:BindingBuffer平衡Ni+-NTA柱后，上样含可溶性重组多肽的上清，先用Washingbuffer洗去杂蛋白，再用不同浓度的咪唑TisHC1洗脱，目的多肽在洗脱浓度为250mmolLImidazole，0.5molLNaCl，20mmolLTrisHCl，pH8.0洗脱下来。[0015]所述的美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白在抗真菌活性中的应用。[0016]有益效果：与现有技术相比，本发明通过基因重组方法获得美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白，并在大肠杆菌中获得高效表达，目的多肽经过HPLC分析达到大95%的纯度，通过质谱分析，分子量与预测多肽分子量也吻合。经检测，多肽具有明显的抗真菌活性，所制备的目的多肽，其活性高、成本低。附图说明[0017]图1是pET-SUM〇-ABP-dHC-CecropinA质粒图；[0018]图2是融合多肽SUM0-ABP-dHC-CecropinA37°C诱导表达12%SDS-PAGE图；[0019]图3是融合多肽SUM0-ABP-dHC-CecropinA纯化12%SDS-PAGE图；[0020]图4是SUMO酶切SUMO标签并获得ABP-dHC-CecropinA的4-20%梯度SDS-PAGE电泳图；[0021]图5是SUM0酶切SUM0标签并获得ABP-dHC-CecropinA的质谱分析图；[0022]图6是表达的ABP-dHC-CecropinA抗真菌抑菌圈图。具体实施方式[0023]下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。[0024]在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。以下实施例中使用的美国白蛾由徐州林业站提供。[0025]实施例1克隆CecropinAcDNA[0026]1、提取美国白蛾总RNA。[0027]应用RNA抽提试剂TIANGEN按照其操作手册提取美国白蛾蛹脂肪体的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度，大于95%，紫外分光光度计测定其浓度为720ngyL，满足使用需求。[0028]2、米用TransgencDNA逆转录试剂盒转录为第一链cDNA。[0029]1引物设计:根据NCBI惜古比天蚕，家蚕及果蝇CecropinA序列比对设计兼并引物：[0030]Cec-Al:5’-ATGAATTTCNCAANAATNNTNTNCTTCGT-3,，[0031]Cec-A2:5’-NTATTTNCNAANGNTTTTNCNGTACCCAG-3’。[0032]2逆转录:在DEPC处理的1•f5mLEppendorf管中依次加入总RNA抽提物3uL，01igodTi80.5ygliLlliL，2XTSReactionMix10liL，DEPC水5yL，TransSc;riptRTRIEnzymeMixlyL;42°C孵育3〇min，85°C加热5min失活TransScriptRT。将得到的cDNA分装后-20°C保存。[0033]3PCR:利用逆转录所得模板进行PCR，体系为25yL，10_〇1L上、下游引物上游引物：5’_ATGAATTTCTCAAGAATTTTATTCTTC-3’，下游引物：5’_TTATTTTCCTAATGCTTTTGCGGTAC-3’）各lyL，2_5mmolLdNTP2yL，10XDreamTaqbuffer2_5yL，cDNA模板1.5此，DreamTaq酶0.3yL，加ddH2016.7yL。反应程序为：94°C5min，（94°C30s，58°C30s，72°Clmin，30个循环，最后72°C延伸lOmin。反应完成后将产物于1%琼脂糖凝胶中电泳分离，用胶回收试剂盒回收得到DNA条带，克隆入pMD19-T载体，经含Amp抗生素50mgmL的琼脂糖平板筛选转化子，挑出阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱基序列测定，得到192bp的片段，将该序列与惜古比天蚕和家蚕CecropinA比对，具有很高的同源相似性，因此确定该序列为美国白蛾CecropinA美国白蛾ABP-cffiC-CecropinA的cDNA，序列如SEQIDN0.1所示，共440碱基，其中1-58号碱基为该基因的5’UTR非编码区，59-247号碱基是该基因的全长编码序列0RF区，翻译63个氨基酸从137-247号碱基是该基因的功能区，翻译37个氨基酸），248-250为终止密码子序列，251-440号碱基为该基因的3’UTR非编码区。所表达的蛋白序列如SEQIDN0.2所示，共63个氨基酸，为基因的0RF区表达产物。[0034]实施例2美国白蛾ABP-cffiC-CecropinA大肠杆菌体外表达[0035]将美国白蛾ABP-CecropinA序列构建到pET-SUMO质粒中区，如图1所示，获得pET-SUMO-ABP-cfflC-CecropinA，具体构建方法如下：[0036]1根据实施例1获得的ABP-cfflC-CecropinA序列设计引物A1、A2，[0037]A1序列：5’-CAGGTGGAAGATCTTTAAGAAMTCG-3’，[0038]A2序列：5’-CCCAAGCTTTTATTTTCTTAATGCTTTTGC-3,；[0039]其中A1的5’端具有Shi酶切位点，A2的5’端具有im册酶切位点。[0040]以美国白蛾DNA为模板进行PCR，将PCR产物割胶回收，回收产物用Std和ffijeM酶切，SUM0载体只用酶切，T4DNALigase连接酶切后的载体和PCR产物，连接产物转化£.coh_toplO中，获得含pETSUMO-cfflC-CecropinA重组菌株。挑选阳性重组菌株，扩大培养提取pETSUMO-cWC-CecropinA重组质粒，转化到大肠杆菌BL21DE3中，挑选阳性菌株诱导表达，融合多肽SUM0-ABP-dHC-CecropinA37°C诱导表达结果如图2所示。[0041]2IPTG浓度0.2mmolL，低温（16。0诱导含有重组载体pETSUM〇-ABP-dC-CecropinA的大肠杆菌表达菌株BL21DE320小时后，4°C收菌，冰上超声破碎（160W，工作4s，暂停8s，共99次表达菌体，4°C，13000g，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+-NTA柱。简要过程是:BindingBuffer平衡Ni+-NTA柱后，上样含可溶性重组多肽的上清，先用WashingbufTer20mmolLImidazole，0.5molLNaCl，20mmolLTrisHCl，pH8_0洗去杂蛋白，再用不同浓度的咪唑TisHC1洗脱，目的多肽在洗脱浓度为250mmolLImidazole，0.5molLNaCl，20mmolLTrisHCl，pH8.0洗脱下来。收集目的多肽美国白蛾ABP-cffiOCecropinA透析过滤除菌后保存。[0042]融合多肽SUM0-ABP-dHC-CecropinA纯化电泳图如图3所示，SUM0酶切SUM0标签并获得ABP-dHC-CecropinA的电泳图如图4所示，ABP-dHC-CecropinA的质谱分析图如图5所示，可见目的多肽经过HPLC分析达到95%的纯度，且分子量与预测多肽分子量也吻合。[0043]实施例3美国白蛾ABP-cfflC-CecropinA抗真菌活性鉴定[0044]1抗白色念珠菌白色念珠菌Cam•出aalbicans活性鉴定[0045]采用琼脂糖孔穴扩散法测定大肠杆菌表达抗菌肽美国白蛾ABP—^见―Cecr〇pinA对白色念珠菌Cam'diaalbicans的抗菌活性。接种Cam'cfiaalbicans于液体土豆培养基，25°C200rpm培养2小时，按1%菌量加至融化的土豆琼脂糖培养基中（35-50。〇，混勾后按1OmL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于25»c培养箱48小时，观察抑菌活性，结果见图6A，具有明显的抗真菌活性。[0046]2抗粗糙脉孢菌JVeurosporacrassa活性鉴定[0047]采用琼脂糖孔穴扩散法测定大肠杆菌表达抗菌肽美国白蛾ABP—A对粗糙脉孢菌Afeurosporacrassa的抗菌活性。接种Afeurosporacrassa于液体土豆培养基，25°C200rpm培养2小时，按1%菌量加至融化的土豆琼脂糖培养基中（35-5〇。〇,混勾后按10mL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于25°C培养箱48小时，观察抑菌活性，结果见图部，具有明显的抗真菌活性。[0048]3抗根霉菌sp的活性鉴定[0049]采用琼脂糖孔穴扩散法测定大肠杆菌表达抗菌肽美国白蛾ABP—Cecr〇pinA对根霉菌Wiizopussp的抗菌活性。接种Wjizopussp于液体土豆培养基，25°C200rpm培养2小时，按1%菌量加至融化的土豆琼脂糖培养基中（35-50。〇,混匀后按1〇mL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于烈培养箱48小时，观察抑菌活性，结果见图6C，具有明显的抗真菌活性。[0050]4抗镰刀菌Fusariunsp的活性鉴定[0051]米用琼脂糖孔穴扩散法测定大肠杆菌表达抗菌肽美国白蛾ABP-dC-CecropinA对镰刀菌Fusariunsp的抗菌活性。接种Fusariiffisp于液体土豆培养基，25°C200rpm培养2小时，按1%菌量加至融化的土豆琼脂糖培养基中（35-50。〇,混匀后按1〇mL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于25»c培养箱48小时，观察抑菌活性，结果见图6D，具有明显的抗真菌活性。[0052]5抗链格孢藤4Jte:raa:riasp的活性鉴定[0053]米用琼脂糖孔穴扩散法测定大肠杆菌表达抗菌肽美国白蛾ABP-cfflC-CecropinA对链格孢菌Xitemariasp的抗菌活性。接种litemariasp于液体土豆培养基，25。〇200rpm培养2小时，按1%菌量加至融化的土豆琼脂糖培养基中（35—5〇。〇,混匀后按1〇mL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测的样品后置于25t：培养箱48小时，观察抑菌活性，结果见图册，具有明显的抗真菌活性。[0054]6抗毛霉菌Mucorsp的活性鉴定[0055]米用琼脂糖孔穴扩散法测定大肠杆菌表达抗菌肽美国白蛾ABP-cfflC-CecropinA对毛霉菌Mucorsp的抗菌活性。接种Mucorsp于液体土豆培养基，25°C200rpm培养2小时，按1%囷量加至融化的土S琼脂糖培养基中（35-50。〇，混句后按l〇mL皿铺于无菌一次性平皿。丨规固后，在无囷条件下打孔，加入待测的样品后置于25°C培养箱48小时，观察抑菌活性结果见图6F，具有明显的抗真菌活性。一’

权利要求：1.美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白在抗真菌活性中的应用;所述的美国白蛾SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白，由以下步骤获得：1根据美国白蛾天蚕素A基因序列设计引物A1、A2,以美国白蛾DNA为模板进行PCR，将PCR产物割胶回收，回收产物用Stul和Hindm酶切，SUMO载体只用Hindm酶切，T4DNALigase连接酶切后的载体和PCR产物，连接产物转化E.colitoplO中，获得含pETSUMO-ABP-dHC-CecropinA重组菌株;挑选阳性重组菌株，扩大培养提取pETSUMO-ABP-dHC-CecropinA重组质粒，转化到大肠杆菌BL21;2IPTG浓度0.2mmolL，低温诱导含有重组载体pETSUMO-ABP-dHC-CecropinA的大肠杆菌表达菌株BL21，20小时后4°C收菌，冰上超声破碎表达菌体，4°C，l3〇OOg，2〇min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+_NTA柱洗去杂蛋白，收集目的多肽透析过滤除菌后保存；其中，美国白蛾ABP-dHC-CecropinA融合蛋白的编码基因序列如SEQIDN0.1所示；所述的应用为SUMO-ABP-dHC-CecropinA融合蛋白经SUMO酶切SUMO标签获得的ABP-dHC-CecropinA在抗真菌活性中的应用。

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