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申请/专利权人：北京市农林科学院

摘要：本发明提供一种鸡C型禽偏肺病毒毒株aMPVC-JCZ及其应用，所述病毒毒株的保藏号为CGMCC No.10889。该病毒是一种鸡来源禽偏肺病毒C亚型野生型毒株。野外分离的该病毒在SPF鸡上进行回鸡实验，引发严重呼吸道感染临床症状，造成气管和肺部病理损伤，经过M基因序列测序证实该病毒是禽偏肺病毒C亚型。病毒稀释后在SPF鸡胚上测定病毒滴度，试验结果显示EID50为10-4.60.2ml。这是国内首次分离到鸡C型禽偏肺病毒，与禽偏肺病毒A和B亚型在基因型和抗原上存在较大的差异。为进一步研究aMPV的致病机制以及开展有效防控该病的疫苗研究提供直接支持。

主权项：鸡C型禽偏肺病毒毒株aMPVC‑JCZ，其保藏号为CGMCC No.10889。

全文数据：一种鸡C型禽偏肺病毒毒株aMPVC-JCZ及其应用技术领域本发明属于微生物动物病毒领域，具体涉及一株鸡C型禽偏肺病毒毒株及其相关应用。背景技术禽偏肺病毒AvianMetapneumovirus，aMPV属于副黏病毒科偏肺病毒属，是一个有囊膜包裹的、不分节的、单股负义RNA病毒。禽偏肺病毒感染是一种新发传染病，能够在火鸡和鸡等禽类中引起急性的、高传染性的上呼吸道感染以及产蛋的下降。禽偏肺病毒感染呈世界性分布。该病毒分为4个亚型：A，B，C和D型，从世界大部分地区如欧洲，亚洲和南美分离到的是A或者B型，C型感染在美国、法国以及韩国有报道。D型感染目前只在法国发现。核苷酸序列分析显示，在美国发现的C型禽偏肺病毒毒株有90％同源性，但是与A和B型只有40-70％的同源性。与其它三种亚型相比，C型禽偏肺病毒在系统进化发育上与同属的人偏肺病毒更为接近。2009～2015年我们先后从全国8个省市20多个地区的70多个鸡场，收集了不同日龄、不同品种的原种鸡、种鸡及商品肉鸡的血清样品，进行该病的流行病学调查，发现所调查的鸡群中aMPV感染平均总阳性率为60.45％，个别鸡场阳性率达100％，这些调查数据表明我国不管是地方品种，还是国外引种的白羽鸡，aMPV感染都普遍存在。2012年在我国东南部进行流行病调查时发现，发病鸡场的病鸡出现严重的、急性的呼吸道临床症状，经过回鸡试验和序列测定证实该病是由鸡C型禽偏肺病毒感染引起。这是我们在国际上首次发现鸡C型禽偏肺病毒感染。由于目前国内尚无针对禽偏肺病毒感染的疫苗，造成禽偏肺病毒感染对禽类的生长性能以及经济效益产生严重影响，这一现状已成为国内养殖环境中普遍现状。禽偏肺病毒感染是一种新发传染病，鸡C型禽偏肺病毒感染引起商品代鸡出现严重的呼吸道症状，并且该病毒的遗传性和抗原性与原来发现的A亚型和B亚型存在明显的差异，为了更好地研究致病机制以及有效预防和控制该疾病必须对病毒进行分离。发明内容本发明的目的在于提供一株新的禽偏肺病毒，本发明的目的还在于提供所述禽偏肺病毒的应用。本发明从我国东南部发病鸡场通过分离鉴定得到了一株新的鸡C型禽偏肺病毒毒株，命名为aMPVC-JCZ，该病毒该病毒已于2015年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，邮编100101保藏，分类命名为禽偏肺病毒Avianmetapneumovirus，保藏号为CGMCCNo.10889。通过回鸡试验证实由aMPVC-JCZ单独感染即可引起商品代黄羽肉鸡严重的呼吸道症状；肺部和气管的病理检查发现，病毒感染引起严重的炎性病理损伤。通过RT-PCR扩增组织中的病毒的M基因发现，该病毒是鸡C型禽偏肺病毒，病毒遗传上与A亚型和B亚型同源性只有70.6％-71.7％。根据该病毒的流行情况调查显示，aMPV感染普遍存在，且C亚型为优势毒株。。具体地，该病毒有如下特征：1发病病鸡表现出严重的、急性的呼吸道临床症状：眼部有分泌物、流鼻涕、结膜炎、面部肿胀、啰音、眼眶周围和眶下窦肿胀、鼻窦炎，以及鼻窦和气管有黄色或者白色的干酪样物。2使用10日龄SPF鸡胚进行病毒测定发现24-96小时的鸡胚发育受阻，肝脏和身体有出血点。3SPF鸡回归试验发现，病毒感染后3-5日发生严重的呼吸道临床症状，病理检查发现，气管和肺部病理损伤严重：上皮结构破坏，上皮细胞和纤毛脱落；炎性细胞的浸润。气管上皮和固有层出现出血，淋巴细胞浸润和增生；肺部有支气管淋巴细胞浸润和粘膜下层水肿增厚，以及淋巴样细胞增生。由于单核细胞浸润和水肿引起肺泡间质弥漫性温和扩张。在支气管腔可见脱落的上皮细胞，异噬细胞，巨噬细胞以及不规则的碎片等。4使用RT-PCR对病毒M基因的扩增和测序发现，M基因全长765bp。进行系统发育和分子进化分析发现，aMPV-JCZ与C型禽偏肺病毒同源性为96.0％-96.7％，而与A和B型只有70.6％-71.7％的同源性。本发明还提供所述的鸡C型禽偏肺病毒毒株aMPVC-JCZ在制备防治禽偏肺病毒感染引起的疾病的疫苗中的应用。所述禽偏肺病毒感染引起的疾病可以是禽偏肺病毒感染引起急性上呼吸道疾病产蛋下降等。本发明的有益效果是提供了一株新的禽偏肺病毒毒株aMPVC-JCZ，该毒株是国内首次分离得到的鸡C型禽偏肺病毒，在SPF鸡中引起特征临床症状，可以用于研究C型禽偏肺病毒的致病机制，以及疫苗制备中强毒攻击模型的建立等。可用于制备中疫苗生产毒种，制备疫苗，用于防治禽偏肺病毒感染引起的疾病。附图说明图1病毒感染SPF鸡，接种病毒3-5日病鸡出现面部肿胀A，鼻腔充满浓浊鼻液B、鼻窦内有干酪样物C以及气管内有粘液D。图2病毒感染SPF鸡的病理检查，A正常气管纤毛；B气管和粘膜下层的炎性细胞浸润；C正常肺组织；D肺部的炎性细胞浸润。图3病毒的M基因序列与病毒各亚型基因进行比对。图4病毒接种SPF鸡胚，A正常SPF鸡胚；接种后死亡的鸡胚B以及发育受阻的鸡胚C。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1aMPVC-JCZ病毒的分离及鉴定1、病料的采集以及病毒的分离：病料来自于我国东南部一发病鸡场，发病鸡只发生严重的呼吸道临床症状，严重影响鸡只的生长性能。无菌采集发病鸡只的鼻甲、气管、喉头和肺，称重后按照1：4重量比加入含有1％青链霉素双抗的灭菌的PBS，研磨后，以3500rpm离心15分钟，将上清保存在-80℃冰箱中。2、动物回归实验随机分组2周龄SPF鸡，滴鼻点眼接种200微升的组织来源病毒，逐日观察实验组的临床症状，接种后第二天个别鸡只开始出现鼻部湿润，在接种的第3日进行收集鼻液和咽拭子提取RNA，RT-PCR反应检测病毒。接种后第5天全部出现明显精神沉郁，部分出现甩头打喷嚏，可听见明显的呼噜声，鸡只在鼻部有半透明的黏液分泌出来，个别面部肿胀图1A。接种后5天剖杀，可见气管内粘液，鼻窦内有干酪样物图1B、C、D。在接种的第5日进行剖检，取发病鸡只的敏感组织进行病理切片检查，可见气管和粘膜下层的炎性细胞浸润，以及肺部的炎性细胞浸润图2。3、RT-PCR法扩增病毒的M基因，进行测序和比对：收集病鸡组织或者病毒培养物，使用QiagenRNeasyMiniKit提取总RNA，使用SuperScriptTMⅢKit以及M基因特异性引物，合成的禽偏肺病毒cDNA为模板进行RT-PCR扩增，扩增产物以琼脂糖凝胶电泳检测，回收后连接在T载体上，克隆成功后由上海生工生物工程技术有限公司进行测序。M基因SEQIDNo.1和GenBank上登记的A、B、C亚型禽偏肺病毒，依据MEGA5.10和DNAstar软件进行序列同源性比较和构建系统发育树，发现aMPV-JCZ与C型禽偏肺病毒同源性为96.0％-96.7％，而与A和B型只有70.6％-71.7％的同源性图3。将该病毒细胞适应毒株命名为aMPVC-JCZ，该病毒已于2015年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，邮编100101保藏，分类命名为禽偏肺病毒Avianmetapneumovirus，保藏号为CGMCCNo.10889。实施例2SPF鸡胚测定病毒滴度保存病毒可直接通过尿囊腔接种SPF鸡胚检测病毒滴度。首先，将保存病毒进行连续10倍稀释，分别接种5枚SPF鸡胚，每胚接种200微升。在38℃，湿度为40％的孵育箱中孵育，24小时观察弃去死胚，随后每8小时观察鸡胚死亡情况。接种一周后将鸡胚置于4℃冰箱冷却，消毒后镊子击破卵壳，除去壳膜后撕破绒毛尿囊膜，吸出尿囊液，其内含有大量病毒，收集后冻于-80℃保存；同时取出鸡胚，观察鸡胚死亡或者变弱鸡胚停止发育，出血或毛发稀疏。根据Reed－Muench法计算病毒的EID50，lgEID50＝10-4.60.2ml。图4中A为对照组，接种PBS。B和C为不同浓度病毒接种后引起鸡胚发育受阻以及死亡。实施例3aMPVC攻毒模型的建立以及最小攻毒剂量的确定随机分组2周龄SPF鸡，每组10只，滴鼻点眼接种100EID50、200EID50、500EID50、1000EID50、5000EID50、10000EID50的aMPVC-JCZ，逐日观察实验组的临床症状，其中100EID50接毒组鸡只未见发病，200EID50组仅有2只呈现轻微呼吸道症状。500EID50接种组在接种后第3日有4只鸡发生明显的呼吸道症状。第5日全部鸡只发病见表1。在研制疫苗的过程中，需要建立实验动物攻毒模型，鸡C型禽偏肺病毒属于新发传染病，目前国内尚无指定的攻毒模型评价疫苗效果。使用本发明的500EID50aMPVC-JCZ接种SPF鸡临床发病率达90％以上，可以用作评价疫苗的有效性及保护效果。表1：滴鼻点眼途径接种不同EID50aMPVC-JCZSPF鸡只发病统计实施例4aMPVC用作评价疫苗的有效性及保护效果疫苗为禽偏肺病毒aMPVC-JCX，该病毒已于2015年6月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，邮编100101保藏，分类命名为禽偏肺病毒Avianmetapneumovirus，保藏号为CGMCCNo.10900。aMPVC-JCX的为aMPVC-JCZ的弱毒活疫苗，由aMPVC-JCZ经若干次传代后筛选获得。根据Reed－Muench法计算病毒的TCID50，lgTCID50＝10-4.20.1ml。21日龄SPF鸡随机分成5组，每组10只。分别设为：健康对照组，aMPV-JCX2000TCID50免疫组，5000TCID50免疫组，10000TCID50免疫组，以及未免疫攻毒组。免疫3周后，除健康对照组外，其余四组均通过滴鼻点眼途径接种500EID50aMPV-JCZ进行攻击，逐日观察临床症状。结果发现，攻毒组全部发病，有明显的呼吸道症状。2000TCID50以及5000TCID50组能够起到部分保护，保护率分别是50％和70％。10000TCID50免疫组完全保护保护率100％。说明，使用aMPV-JCX细胞毒能够对鸡C型禽偏肺病毒感染引起的呼吸道症状起到良好的保护效果，aMPVC-JCZ可以用作评价疫苗的有效性及保护效果。表2.用aMPV-JCZ评价aMPVC-JCX保护率

权利要求：1.鸡C型禽偏肺病毒毒株aMPVC-JCZ，其保藏号为CGMCCNo.10889。2.权利要求1所述的鸡C型禽偏肺病毒毒株aMPVC-JCZ在制备防治禽偏肺病毒感染引起的疾病的疫苗中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述禽偏肺病毒感染引起的疾病为禽偏肺病毒感染引起上呼吸道疾病、产蛋下降。4.权利要求1所述的鸡C型禽偏肺病毒毒株aMPVC-JCZ在制备疫苗生产毒种中的应用。

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