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申请/专利权人：郑州大学

摘要：本发明涉及药物化学领域，具体公开了一种利用HTRF技术筛选UBC12Dcn1小分子抑制剂的方法。该方法先成功构建并原核表达纯化得到纯度较高的GST‑Dcn1重组蛋白，合成UBC12 N末端乙酰化修饰的1‑12个氨基酸序列作为底物。用分子间相互作用确定UBC12和Dcn1有活性并且能相互作用；然后再利用HTRF技术建立优化的UBC12Dcn1活性测定平台。该反应体系稳定，可耐受较宽的pH范围5.5‑8.0及二价金属离子、螯合物等；背景低，受到样品的干扰非常少，假阳性假阴性均低，可去除天然产物自发荧光的干扰，灵敏度高；易于实现微型化，通量高。

主权项：利用HTRF技术筛选UBC12Dcn1小分子抑制剂的方法，其特征在于，通过如下步骤实现：1GST‑Dcn1重组蛋白的表达纯化（a）GST‑Dcn1表达载体的构建：选择表达载体PGEX‑4T‑1及目的基因活性片段GST‑Dcn1，将其克隆到表达载体上;b GST‑Dcn1重组蛋白的表达：将步骤（a）构建成功的目的载体转化进入BL21DE3表达菌株中，将菌液均匀涂布到混有抗生素的固体培养基上，挑单克隆筛选出含有目的质粒的菌株进行培养：表达蛋白时先将目的菌株接种到液体培养基中37℃进行扩大培养，待菌处于生长期OD 0.6‑0.9时加入异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导目的蛋白的表达；所述抗生素选氨苄青霉素，终浓度100µgml ；c GST‑Dcn1重组蛋白的纯化：离心收集步骤（b）菌液中的菌体，然后超声破碎释放目的蛋白，高速离心弃去菌体碎片，得到目的蛋白溶液;根据构建表达载体时选择的载体特征选择合适的纯化柱、纯化条件、缓冲液纯化收集蛋白样品；d 表达纯化结果：取步骤（c）蛋白纯化时收集的蛋白样品，加入蛋白loading buffer 变性，然后SDS‑PAGE胶电泳，用考马斯亮蓝染液染胶，在目的蛋白大小处有蛋白条带;2HTRF技术筛选UBC12Dcn1小分子抑制剂平台的建立根据HTRF方法特征选择检测试剂，缓冲溶液中，检测UBC12和Dcn1的相互作用；通过发射波长665nm时的信号值与620nm时信号值的比值判断两种生物分子相互作用的强度，从而筛选UBC12Dcn1小分子抑制剂。

全文数据：利用HTRF技术筛选UBC12Dcn1小分子抑制剂的方法技术领域[0001]本发明涉及药物化学领域，具体涉及利用HTRF技术筛选UBC12Dcnl小分子抑制剂的方法。背景技术[0002]泛素ubiquitin可共价结合并修饰细胞内多种蛋白质，使其多聚泛素化被26S蛋白酶体识别而降解，这种蛋白质翻译后修饰已经成为当今细胞分子生物学研究的热点。目前各种类泛素修饰蛋白也不断被发现，如SUMOsmallubiquitin-relatedmodifier、NEDD8neuralprecursorcell-expresseddevelopmentalIydownregulated8、Atg8autophagygene8和Atgl2等。其中，NEDD8与泛素高度同源，具有60%的一致性和80%的相似性。NEDD8特异性地结合到底物蛋白赖氨酸残基上的修饰过程被称为Neddylation，Neddylation与泛素化类似，也需要经过NEDD8特异性El、E2、E3将NEDD8传递到底物CRLsCullin-RING-ubiquitinIigases上。NAEAPPBP1UBA3异质二聚体活化NEDD8并将其转移到E2结合酶UBC12或UBE2F上，然后E2结合酶和E3连接酶相互作用使NEDD8与CRLs上的cullin蛋白C端赖氨酸残基结合，进而活化CRLs加速其底物蛋白的降解（Huangetal.，2009;Lecketal.，2010;Lietal.,2014aNeddylation通路异常可以诱发癌症Gaoetal.，2014;Lietal.,2014及免疫应答疾病（LeNegrate，2012;Mathewsonetal·，2013。抑制Neddylation通路可以引起细胞周期阻滞、衰老或凋亡，从而抑制细胞增殖;也可以抑制IkB的泛素化降解从而减少NF-KB的移位和活化，进而抑制免疫应答疾病。[0003]在neddylation过程中E2结合酶发挥重要作用，首先E2与El结合，NEDD8传递到E2上与E2形成硫酯键。对于RINGE3，E2与E3相互作用将NEDD8直接传递到CRLs上。其中，NEDD8从UBCl2传递到CulIins的过程涉及两个E3:①RBXl，一种RINGE3，其RING结构域与UBC12和Cullinl相互作用将UBC12的催化活性位点Cyslll和CULl上NEDD8结合位点Lys720拉近，使NEDD8从UBC12直接传递到CULl上；②DcnlDefectiveincullinneddylationI，也叫做SCCR0、DCUN1DI，一种co_E3,是neddylationscaffold-typeE3连接酶的组分之一，可以直接与NEDD8、RBX1和Cullin1结合（Heiretal.，2013;Huangetal.，2011;Kimetal.，2008;Kurzetal.,2008。在细胞核内，Dcnl加强Cullinl对UBC12的招募，促进neddylation，也可催化NEDD8连接到Cullin2的K689Acnl晶体结构主要包括UBA结构域和PONYpotentiatingneddylation结构域两部分。DcnlPONYDcnlp结构域中两个EF-hand-like折叠连接处形成一个保守的疏水口袋，与N末端乙酰化的UBC12相互作用加强neddylation过程（Mondaetal.，2013;Scottetal.,2011;Scottetal.,2010。Dcnl已被报道是一种致癌基因，Dcnl的mRNA和蛋白水平在多种肿瘤，如肺癌、头颈癌等及癌症病人组织中均高表达，Dcnl过表达也可促进癌细胞的增值和转移，DcnIknockdown可以引起癌细胞的周期阻滞和凋亡（Sarkariaetal.,2006。综上所述，通过建立UBC12Dcnl抑制剂筛选平台，筛选出能抑制neddylation通路的化合物对癌症及免疫性疾病的治疗有重要意义，因此，UBC12Dcnl可以作为一个治疗靶点。发明内容[0004]本发明的目的在于利用HTRF技术建立UBC12Dcnl抑制剂筛选平台，筛选出能抑制neddyIation通路的先导化合物。[0005]HTRF均相时间分辨焚光，HomogeneousTime-ResolvedFluorescence结合了焚光共振能量转移FRET,FluorescenceResonanceEnergyTransfer和时间分辨焚光TRF，Time-ResolvedFluorescence两种技术，将FRET的均相实验方式和TRF的低背景特点融合在一起。因此，HTRF技术具有操作简单、灵敏度高、通量大、实验数据稳定可靠的特点。HTRF是以铕穴状化合物Eu3+Cryptate或Lumi4™钺穴状化合物（Tb2+Cryptate为能量供体Donor，能耐受一些特殊的实验条件，如二价阳离子Mg2+和Mn2+等）、螯合物EDTA、极性较强的溶剂或者较高的温度，可耐受较宽的pH范围；以XL665或d2为能量受体Acceptor，XL665和d2激发波长为620nm，发射波长为665nm，位于近红外光区，进一步降低了样品本身对实验的影响。XL665是改良过的别藻蓝蛋白（APC，将APC的亚基偶联，使其不能解离，增加其稳定性;d2光谱学特征与XL665相同，但其分子量较小，可减少空间位阻对实验的影响。[0006]HTRF技术的原理:两种能相互作用的生物分子使焚光基团Donor和Acceptor靠近，穴状化合物Donor捕获激发光获得的能量部分释放，发射波长为620nm，另一部分能量共振转移到AcceptorXL665或d2，使其发射能量，发射波长为665nm。发射波长665nm的信号值与620nm时信号值的比值能反映出两种生物分子相互作用的强度。[0007]为达到本发明目的，本发明先成功构建并原核表达纯化得到纯度较高的GST-Dcnl重组蛋白，合成UBC12N末端乙酰化修饰的1-12个氨基酸序列作为底物。首先用分子间相互作用确定UBC12和Dcnl是有活性的并且能相互作用;然后再利用HTRF技术建立UBC12Dcnl活性测定平台，并优化其反应条件。具体步骤如下：[0008]一、GST-Dcnl重组蛋白的表达纯化[0009]UGST-Dcnl表达载体的构建:选择合适的表达载体及目的基因活性片段。选择的表达载体要能表达出可溶性的目的蛋白，要有明确的抗性及标签，方便目的蛋白的表达和纯化。选择的目的基因序列要包括其活性中心，确保后续实验的可行性；[0010]为此，本发明筛选出的表达载体为PGEX-4T-1;目的基因序列活性片段为GST-Dcnl，将其克隆到表达载体上。[0011]2、GST-Dcnl重组蛋白的表达:将构建成功的目的载体转化进入合适的表达菌株，将菌液均匀涂布到混有抗生素的固体培养基上，挑单克隆筛选出含有目的质粒的菌株进行培养。表达蛋白时先将目的菌株接种到液体培养基中37°C进行扩大培养，待菌处于生长期0D0.6-0.9时加入IPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导目的蛋白的表达；[0012]所述表达菌株选BL21DE3，所述抗生素选氨苄青霉素，终浓度100ygml;[0013]3、GST-Dcnl重组蛋白的纯化:离心收集上述菌液中的菌体，然后超声破碎释放目的蛋白，高速离心弃去菌体碎片，得到目的蛋白溶液。根据构建表达载体时选择的载体特征选择合适的纯化柱、纯化条件、缓冲液等纯化收集蛋白样品；[0014]4、表达纯化结果：取上述蛋白纯化时收集的蛋白样品，加入蛋白loadingbuffer变性，然后SDS-PAGE胶电泳，用考马斯亮蓝染液染胶，看到在目的蛋白大小处有蛋白条带。可进一步用相应抗体或质谱等技术检测确认。[0015]二、HTRF技术筛选UBCl2Dcn1小分子抑制剂平台的建立[0016]根据HTRF技术产品的特征选择合适的检测试剂，缓冲溶液中，检测UBC12和Dcnl的相互作用；[0017]本发明优选:Anti-GST-CryptateEu3+Cryptateconjugatedmousemonoclonalantibodyanti-glutathioneS—transferase作为會^量供体，Streptavidin_d2d2-conjugatedstreptavidin作为能量受体，缓冲溶液中，固定Dcnl浓度，将Biotin-UBC12配制成一系列浓度梯度，室温反应，确定Biotin-UBC12最适浓度为2.84μΜ;同理，固定Biotin-UBC12浓度，将Dcnl配制成一系列浓度梯度，确定Dcnl最适浓度为20ηΜ。在此条件下，GST-Dcnl、Biotin-UBC12有较好的相互作用。通过发射波长665nm时的信号值与620nm时信号值的比值判断两种生物分子相互作用的强度，从而筛选UBC12Dcnl小分子抑制剂。[0018]本发明的优点在于：[0019]1、操作简单:实验过程中不需洗板，孵育后直接检测；[0020]2、反应体系稳定:穴状化合物非常稳定，可耐受较宽的pH范围（5.5-8.5及二价金属离子、螯合物等；[0021]3、数据真实可靠:背景低，受到样品的干扰非常少，假阳性假阴性均低，可去除天然产物自发荧光的干扰，灵敏度高；[0022]4、易于实现微型化，通量高。附图说明[0023]图1为PGEX-4T1-Dcnl纯化结果。[0024]图2为利用HTRF技术检测UBC12和Dcnl相互作用的原理图。[0025]图3为利用HTRF技术原理优化UBC12和Dcnl浓度，图中a为UBC12浓度，b为Dcnl浓度，最终确定UBC12终浓度为2.84yM、Dcnl浓度为20nM。具体实施方式[0026]为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：除不另加说明以外，以下所述百分含量均为质量百分含量。[0027]实施例1[0028]一、GST-Dcnl重组蛋白的表达纯化[0029]试剂和方法：[0030]氨苄青霉素的制备:称量Ig氨苄青霉素用超纯水溶解并定容至l〇ml，在超净台里用灭菌的0·22um的滤头过滤，-20°c保存；[0031]IOOmMIPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的配制：称量2.383gIPTG用超纯水溶解并定容至IOOml，在超净台里用灭菌的0·22um的滤头过滤，-20°C保存；[0032]感受态细胞的制备:将表达菌株BL21DE3按1%。接入灭菌的液体培养基中，37°C摇床培养至对数生长期，取Iml菌液至1.5ml灭菌的EP管里，3000rpm离心5min收集菌体，每管中加入IOOul0.IM灭菌预冷的CaCl2溶液，吹打均匀，然后每管中再加入25ul50%灭菌的甘油，混匀，-80°C保存，备用。[0033]液体培养基的制备:分别称量6g蛋白胨、6g氯化钠、3g酵母提取物至IL锥形瓶里，加入超纯水600ml，121°C高压灭菌20min;[0034]固体培养基的制备：分别称量2g蛋白胨、2g氯化钠、Ig酵母提取物、3g琼脂粉至500ml锥形瓶里，加入超纯水200ml，121°C高压灭菌20min。灭菌结束后将固体培养基室温放置至凉而未凝时加入200μ1氨节青霉素0.5mgml，摇勾，倒入无菌的培养皿里，凝固后4°C保存，备用；[0035]Bindingbuffer的组分：HOmM氯化钠、2.7mM氯化钾、IOmM磷酸氢二钠、1.8mM磷酸二氢钾，pH7.3;[0036]Elutionbuffer的组分：50mMTris-HClpH8·0，IOmM还原性谷脫甘肽。[0037]1、PGEX-4T1-Dcnl表达载体的构建：将Dcnl碱基序列的全长克隆到表达载体PGEX-4T-1上，经测序验证连接正确；[0038]2、PGEX-4TI-Dcn1重组蛋白的表达：将构建成功的重组载体PGEX-4TI-Dcn1转化进入表达菌株BL21DE3，将菌液均匀涂布到混有氨苄青霉素的固体培养基上，37°C孵育过夜，挑单克隆至液体培养基中培养。[0039]按1%。的比例将上述BL21DE3-PGEX-4T1-Dcnl接种到液体培养基中37°C扩大培养，待菌处于对数生长期0D0.6-0.9时加入0.5mMIPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷20°：过夜诱导Dcnl表达；[0040]3、PGEX-4T1-Dcnl重组蛋白的纯化:a.收集菌体:8000rpm5min离心收集上述菌液中的菌体，用Bindingbuffer重悬菌体，8000rpm5min离心弃上清;b.超声破碎:再加入Bindingbuffer重悬菌体，超声破碎冰浴;超声3s，间隔15s，高速离心弃去菌体碎片，得到含有目的蛋白的上清液，〇.22um滤膜抽滤;c.平衡柱子:连接蛋白纯化装置，先用超纯水排净系统中的气泡，然后连接上蛋白纯化柱，先用超纯水冲洗柱子至紫外检测值基本平稳，再换成Bindingbuffer平衡柱子至紫外检测值平稳，将吸光度归零;d.上样:将蛋白样品流经蛋白纯化柱，目的蛋白及少量的杂蛋白与柱子结合，其他杂蛋白直接流穿；e.洗杂蛋白：用Bindingbuffer冲洗柱子至紫外检测值平稳，将柱子上结合的杂蛋白洗脱;f.洗脱目的蛋白：用Elutionbuffer洗脱柱子上结合的目的蛋白；g.依次用Bindingbuffer、超纯水冲洗柱子分别至紫外检测值平稳;h.用20%乙醇保存柱子。[0041]表达纯化结果:从蛋白纯化过程中收集的蛋白样品中分别取出50ul，加入10μ1蛋白6Xloadingbuffer100°C变性lOmin，然后SDS-PAGE胶电泳，用考马斯亮蓝染液染胶，观察到在55KDa处有蛋白条带，是目的蛋白PGEX-4T1-Dcnl。[0042]二、HTRF技术筛选UBCl2Dcnl小分子抑制剂平台的建立[0043]试剂和方法：[0044]HTRF缓冲液的配制：50mMHepes、50mM氯化钠、400mM氟化钾、0.1%[0045]BSA牛血清白蛋白）、0·1%tween20，pH6·0·[0046]I、根据Cisbiο公司HTRF技术产品特征选择Anti-GST-CryptateEu3+Cryptateconjugatedmousemonoclonalantibodyanti-glutathioneS—transferase作为會^量供体，Streptavidin_d2d2-conjugatedstreptavidin作为能量受体，分别与GST-Dcnl、Biotin-UBC12结合检测Dcnl和UBC12的相互作用。[0047]2、缓冲溶液中，固定Dcnl浓度，将Biotin-UBC12配制成一系列浓度梯度，室温反应3h，确定Biotin-UBC12最适浓度为2.84μΜ;同理，固定Biotin-UBC12浓度，确定Dcnl最适浓度为20nM。[0048]3、确定最终反应体系为20μ1，用384孔板检测。反应体系为：[0049][0050]因此，通过发射波长665nm时的信号值与620nm时信号值的比值判断两种生物分子相互作用的强度，从而筛选UBCl2Dcnl小分子抑制剂。

权利要求：1.利用HTRF技术筛选UBCl2Dcnl小分子抑制剂的方法，其特征在于，通过如下步骤实现：IGST-Dcnl重组蛋白的表达纯化aGST-Dcnl表达载体的构建：选择表达载体PGEX-4T-1及目的基因活性片段GST-Dcnl，将其克隆到表达载体上；bGST-Dcnl重组蛋白的表达:将步骤a构建成功的目的载体转化进入BL21DE3表达菌株中，将菌液均匀涂布到混有抗生素的固体培养基上，挑单克隆筛选出含有目的质粒的菌株进行培养:表达蛋白时先将目的菌株接种到液体培养基中37°C进行扩大培养，待菌处于生长期㈤0.6-0.9时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导目的蛋白的表达；所述抗生素选氨苄青霉素，终浓度l〇〇ygml;cGST-Dcnl重组蛋白的纯化:离心收集步骤b菌液中的菌体，然后超声破碎释放目的蛋白，高速离心弃去菌体碎片，得到目的蛋白溶液;根据构建表达载体时选择的载体特征选择合适的纯化柱、纯化条件、缓冲液纯化收集蛋白样品；⑹表达纯化结果:取步骤c蛋白纯化时收集的蛋白样品，加入蛋白loadingbuffer变性，然后SDS-PAGE胶电泳，用考马斯亮蓝染液染胶，在目的蛋白大小处有蛋白条带；⑵HTRF技术筛选UBC12Dcn1小分子抑制剂平台的建立根据HTRF方法特征选择检测试剂，缓冲溶液中，检测UBC12和Dcnl的相互作用；通过发射波长665nm时的信号值与620nm时信号值的比值判断两种生物分子相互作用的强度，从而筛选UBC12Dcnl小分子抑制剂。2.如权利要求1所述的利用HTRF技术筛选UBCl2Dcn1小分子抑制剂的方法，其特征在于，HTRF方法中，选:Anti-GST-Cryptate作为能量供体，51:代卩丨3¥丨1;[11-12作为能量受体，Biotin-UBC12浓度为2·84μΜ，Dcnl浓度为20ηΜ〇

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