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申请/专利权人：厦门大学

摘要：一种抑制WSSV感染的Cq‑Ns1abp基因及其蛋白抗病毒活性应用，涉及白斑综合征病毒。将Cq‑Ns1abp基因连接到原核表达载体pMal‑C2x中，构建红螯螯虾抗WSSV感染调控因子pMal‑C2x‑Cq‑Ns1abp重组表达载体；Cq‑Ns1abp基因产物包含N端BTB结构域和C端Kelch结构域蛋白及全长蛋白；将所得重组表达载转化体分别导入宿主细胞，诱导表达得表达产物，再通过亲和层析获得较高纯度的rCq‑Ns1abp重组蛋白。由于Cq‑Ns1abp对WSSV感染具有抑制作用，对虾类抗病毒免疫具有重要作用，因此红螯螯虾抗WSSV感染调控因子在制备抗病毒感染药物和动物抗病饲料添加剂中应用。

主权项：1.红螯螯虾抗WSSV感染调控因子的基因序列为：

全文数据：一种抑制WSSV感染的Cq-Nslabp基因及其蛋白抗病毒活性应用技术领域[0001]本发明涉及白斑综合征病毒，尤其是涉及一种抑制WSSV感染的Cq-Nslabp基因及其蛋白抗病毒活性应用。背景技术[0002]白斑综合征病毒Whitespotsyndromevirus，WSSV是目前4下类养殖中最严重的病毒性疫病病原。WSSV具有非常广泛的宿主范围和对甲壳类动物强烈的致病性，能够感染对虾、螯虾、蟹和龙虾等[1，2]，已成为水产甲壳动物养殖的主要障碍，对水产甲壳动物养殖业造成严重的经济损失。迄今为止，依然缺乏治疗WSSV病害的有效药物。[0003]甲型流感病毒非结构蛋白NSl-A结合蛋白（NSlABP在人类中被首次报道，因其能够结合甲型流感病毒的非结构性蛋白NSl-A而被命名M13Hela细胞中报道的Nslabp蛋白含有N-末端BTBbric-a-brac，tramtrack,broadcomplexPOZpoxvirusesandzincfingers结构域和约50个氨基酸的五个Kelch样串联重复元件。人Kelch重复结构域是最常见的底物结合结构域，人类基因组含有超过95个含BTB-Kelch结构域的蛋白质[4]。研究表明，Nslabp还参与调控甲型流感病毒mRNA的选择性剪接，在甲型流感病毒基因表达中发挥重要作用[5]。[0004]哺乳动物细胞NsIabp与剪接组装因子SC35共定位于细胞核中，病毒感染会破坏该定位，使之重新定位于整个核质中。果绳和NIH3T3细胞的Nslabp通过其Kelch结构域在细胞质中与肌动蛋白共定位并结合[6,7]，并在细胞骨架重排中发挥重要作用。此外，A549细胞Nslabp在流感病毒感染过程中具有抗凋亡作用[8]。对虾能够利用细胞凋亡途径防御WSSV的感染[9]，然而，在甲壳类动物中关于NsIabp的研究基本上还未见报道，NsIabp是否存在于低等动物中，以及是否参与WSSV的感染均不清楚。[0005]参考文献：[0006]I.SundarRajNjNathigaNambiKSjAbdulMajeedSjTajuGjVimalSjFarookMA,etal.Highefficacyofwhitespotsyndromevirusreplicationintissuesoffreshwaterrice-fieldcrab,ParatelphusahydrodomousHerbst.JFishDis.201235:917-25.[0007]2.JiravanichpaisalP，BangyeekhunE,SoderhalIK,SoderhalII.ExperimentalinfectionofwhitespotsyndromevirusinfreshwatercrayfishPacifastacusleniusculus.DisAquatOrgan.200147:151-7.[0008]3.WolffTjOiNeillREjPaleseP.NSl-BindingproteinNSl-BP:anovelhumanproteinthatinteractswiththeinfluenzaAvirusnonstrueturalNSlproteinisrelocalizedinthenucleiofinfectedcells.JVirol.199872:7170-80.[0009]4.Perez-TorradoRjYamadaDjDefossezPA.Borntobind:theBTBprotein-proteininteractiondomain.Bioessays.200628:1194-202.[0010]5.TsaiPLjChiouNTjKussSjGarcia-SastreAjLynchKffjFontouraBM.CellularRNAbindingproteinsNSl-BPandhnRNPKregulateinfluenzaAvirusRNAsplicing.PLoSPathog.20139:el003460.[0011]6.SasagawaKjMatsudoYjKangMjFujimuraLjIitsukaYjOkadaS,etaI.IdentificationofNdl，anovelmurinekelchfamilyprotein,involvedinstabilizationofactinfilaments.JBiolChem.2002277:44140-6.[0012]7.AdamsJjKelsoRjCooleyL.Thekelchrepeatsuperfamilyofproteins:propellersofcellfunction.TrendsCellBiol.200010:17-24.[0013]8.OthumpangatS，NotiJDjBlachereFM,BeezholdDH.Expressionofnon-structural-ΙΑbindingproteininlungepithelialcellsismodulatedbymiRNA-548anonexposuretoinfluenzaAvirus.Virology.2013447:84-94.[0014]9.WangPHjWanDHjChenYGjWengSPjYuXQjHeJG.CharacterizationoffournovelcaspasesfromLitopenaeusvannameiLvcaspase2-5andtheirroleinWSSVinfectionthroughdsRNA-mediatedgenesilencing.PLoSOne.20138:e80418.发明内容[0015]本发明的第一目的在于提供红螯螯虾抗WSSV感染调控因子Cq-Nslabp的基因序列。[0016]本发明的第二目的在于提供红螯螯虾抗WSSV感染调控因子Cq-Nslabp的氨基酸序列。[0017]本发明的第三目的在于提供红螯螯虾抗WSSV感染调控因子Cq-Nslabp的应用。[0018]所述红螯螯虾抗WSSV感染调控因子命名为Cq-Nslabp。[0019]所述红螯螯虾抗WSSV感染调控因子的基因序列为：[0020][0023]所述红螯螯虾抗WSSV感染调控因子的氨基酸序列为：[0027]所述红螯螯奸Cheraxquadricarinatus抗WSSV感染调控因子的制备方法包括以下步骤：[0028]1将Cq-NsIabp基因连接到原核表达载体pMal_C2x中，构建红螯螯虾抗WSSV感染调控因子pMal-C2x-Cq_Nslabp重组表达载体;所述Cq-Nslabp基因产物包含N端BTB结构域和C端Kelch结构域蛋白及全长蛋白；[0029]2将步骤1所得重组表达载转化体分别导入宿主细胞E.coliBL21:DE3，并进行诱导表达，得表达产物；[0030]在步骤2中，所述诱导表达的条件可为0.ImM硫代半乳糖苷（IPTG、诱导温度16°C、诱导时间20h。[0031]3分离纯化步骤2得到的表达产物，通过亲和层析获得较高纯度的rCq-Nslabp重组蛋白。[0032]在步骤3中，所述rCq-Nslabp重组蛋白可包括rCq-Nslabp-BTB、rCq_Nslabp-KeIch及rCq-NsIabp-Full-Iengtt^0[0033]由于所述Cq-Nslabp对WSSV感染具有抑制作用，对虾类抗病毒免疫具有重要作用，因此红螯螯虾抗WSSV感染调控因子Cq-Nslabp可在制备抗病毒感染药物和动物抗病饲料添加剂中应用。[0034]本发明根据Cq-Nslabp基因序列特征成功构建重组表达载体，在大肠杆菌系统中诱导表达并纯化获得重组蛋白rCq-Nslabp。该重组蛋白能够识别并结合WSSV的囊膜蛋白VP28，且具有较强的抗WSSV感染活性，能有效抑制WSSV在红螯螯虾Hpt细胞中的感染复制，是一种重要的抗WSSV感染调控因子。因此，重组基因工程产品rCq-Nslabp在制备抗WSSV类新药开发应用中显示出非常诱人的应用前景。[0035]构建的红螯螯虾转录组数据库显示，红螯螯虾中存在Nslabp的序列。同时，目前在其他水产类动物中尚未见该基因功能活性的相关报道。红螯螯虾转录组数据显示Nslabp表达能响应WSSV的感染而上调表达，说明红螯螯虾Nslabp参与了WSSV的免疫防御过程，因此开展红螯螯虾Nslabp的表达纯化及活性研究对WSSV的防治具有重要意义。[0036]本发明源于红螯螯虾的Nslabp基因及重组表达蛋白，该基因工程产品能够抑制WSSV在红螯螯虾造血组织Hpt干细胞中的增殖，是一种具有抗WSSV感染活性的基因工程产物，对于WSSV病害的有效防治具有重要应用前景。附图说明[0037]图1为SDS-PAGE分析pMal-C2x-Cq-Nslabp重组载体克隆子诱导表达的电泳图谱。在图1中，M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker，1、2泳道分别为导入重组载体pMal-C2x_Cq-Nslabp-BTB的表达菌诱导前、后的菌液上清，3、4泳道分别为导入重组载体pMal-C2x-Cq-Nslabp-Kelch的表达菌诱导前、后的菌液上清，5、6泳道分别为导入重组载体pMal-C2x-Cq-Nslabp-FulI-Iength的表达菌诱导前、后的菌液上清，2、4、6泳道中分别可见约55kDa、70kDa、130kDa的明显目的蛋白诱导条带。[0038]图2为SDS-PAGE分析pMal-C2x-Cq-Nslabp重组载体克隆子表达产物纯化的电泳图谱。在图2中，M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker，1为表达纯化的rCq-NsIabp-BTB重组蛋白，可见约55kDa的明显蛋白条带，2为表达纯化的rCq-Nslabp-Kelch重组蛋白，可见约70kDa的明显蛋白条带，3为表达纯化的rCq-Nslabp-FulI-Iength重组蛋白，可见约为130kDa的明显蛋白条带。[0039]图3为Pulldown实验验证rCq-NsIabp蛋白特异性识别结合WSSV主要囊膜结构蛋白VP28。在图3中，1为WSSV囊膜蛋白阳性对照，2为不加蛋白的阴性对照，3为加入MBP标签蛋白的阴性对照，4、5、6分别为加入rCq-NsIabp重组蛋白的实验组。2-6中均加入了能特异性识别MBP标签蛋白的琼脂糖珠，用于亲和层析MBP标签蛋白及其互作蛋白。结果表明，阴性对照组2、3泳道与囊膜蛋白VP28不结合，而重组蛋白组4、5、6泳道与VP28有明显结合。[0040]图4为WesternBlot实验验证pulsin转染rCq-Nslabp重组蛋白抑制WSSV感染复制的作用。在图4中，5个样品中均加入了转染试剂pulsin，l为不转染蛋白的阴性对照，2为转染MBP标签蛋白的阴性对照，3、4、5为转染rCq-NsIabp重组蛋白的实验组。结果显示转染rCq-NsIabp重组蛋白的实验组3、4、5泳道），WSSV病毒的感染复制水平明显降低。具体实施方式[0041]以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。[0042]实施例1红螯螯虾抗WSSV感染调控因子Cq-Nslabp原核表达载体的构建[0043]分别设计扩增编码含Cq-NslabpcDNA基因两个重要结构域BTB和Kelch的蛋白及含ORF框的全长蛋白：Cq-NsIabp-BTB的特异性上游引物BTB-Fl和下游引物BTB-Rl，Cq-NsIabp-KeIch的特异性上游引物KeIch-Fl和下游引物KeIch-Rl，Cq-NsIabp-Ful1-length的特异性上游引物Nslabp-Fl和下游引物Nslabp-Rl。分别在各上游引物的5端添加EcoRI酶切位点；在下游引物的3端添加NotI酶切位点及6*His标签，使重组蛋白同时带上MBP和6*His标签，便于进一步的纯化。然后对其相应的结构域区域进行PCR扩增。[0044]Cq-NsIabp-BTB上游引物BTB-Fl:[0045]57-CCGGAATTCTGCGATGTCATCCTCCAGGT-37,[0046]Cq-NsIabp-BTB下游引物BTB-Rl:[0047]57-AATGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTAAATGAGCCACCAGATGCTCA-37,[0048]Cq-Nslabp-Kelch上游引物Kelch-Fl:[0049]57-CCGGAATTCCATCTTTTGGTCTGTGGAGG-37[0050]Cq-Nslabp-Kelch下游引物Kelch-Rl:[0051]57-AATGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTCTCTTCGTATAGTTATCAATGCC-37[0052]Cq-Nslabp-Full-Iength上游引物Nslabp-Fl:[0053]57-CCGGAATTCATGACCTCCACATCTGCACAATC-37[0054]Cq-Nslabp-Full-Iength下游引物Nslabp-Rl:[0055]57-AATGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGATGGCCATTAGTGGCAATTGAA-37[0056]PCR反应条件为:98°C预变性3min;98°C变性10s，55°C退火15s，72°C延伸30s，重复35个循环；72°C延伸lOmin。[0057]利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收PCR产物，然后对PCR产物进行EcoRINotI双酶切，并与同样经EcoRINotI双酶切线性化的原核表达载体pMal-C2x连接，获得重组表达载体pMal_C2x_Cq-Nslabp-BTB、pMal_C2x_Cq-NsIabp-KeIch及pMal_C2x_Cq-NsIabp-Full-length。测序鉴定读码框准确无误。[0058]实施例2重组表达载体pMal-C2x-Cq-Nslabp在大肠杆菌BL21DE3中的诱导表达[0059]1、诱导表达：[0060]1将构建好的重组表达载体转化BL21DE3，并涂布于含氨苄青霉素Amp+抗性的LB平板。[0061]2挑取单克隆菌落，接种于5ml含Amp+的LB培养基中，37°C，200rpm摇床培养12h。[0062]3以1:100的比例接种至IOOml含Amp+的LB培养基中，37°C，200rpm摇床培养至0D600为0.3至0.5。[0063]4加入IPTG至终浓度0.1mM，16°C下150rpm诱导20h。[0064]结果显示，见图12、4、6泳道），IPTG诱导后在菌体中可检测到明显的诱导条带，大小依次为55kDa、70kDa、130kDa左右，说明该条件可以获得较高比例的表达产物。[0065]2、纯化：[0066]1收集菌体，重悬于PBS，超声破碎，并于4°C，12000rpm离心5min。[0067]2如上菌体超声破碎上清可再次离心lOmin，以充分去除不溶菌体团块，并以0.22μπι滤头过滤，即可用于亲和层析纯化。[0068]3用5〜10个柱体积MiIliQ水清洗层析柱。[0069]4平衡:用5〜10个柱体积PBS缓冲液平衡层析柱。[0070]5挂柱:将过滤后的可溶性上清以0.8mlmin全部过柱。[0071]6洗柱：用5〜10个柱体积的洗涤缓冲液50mM磷酸盐[pH7.4]，500mMNaCl，20mM咪唑过柱，洗去非特异结合蛋白。[0072]7洗脱:利用洗脱液50mM磷酸盐[pH7.4]，500mMNaCl，150mM咪挫进行洗脱。[0073]8收集:收集洗脱蛋白，取少量样品进行SDS-PAGE电泳鉴定。[0074]结果显示，纯化洗脱峰对应较为单一的蛋白条带（图2，说明经亲和层析纯化后可以得到纯度较高的重组表达蛋白。[0075]实施例3利用pulldown实验证明rCq-Nslabp重组蛋白与WSSV的识别结合[0076]分别稀释2ug重组蛋白（MBP、rCq_Nslabp-BTB、rCq_NsIabp-KeIch^PIrCq-Nslabp-Full-length，其中control组不加任何蛋白）和5ugWSSV囊膜蛋白于ImlPBS溶液中，加入20ul能够特异性结合MBP标签蛋白的Dextrinbeads，4°C旋转孵育4h。孵育后，500g离心3min，小心去除上清。再用Iml预冷的PBS重悬洗涤，500g离心3min，重复5次。最后用IOmM麦芽糖洗脱beads上的结合蛋白，加入SDS上样缓冲液，煮沸IOmin变性，置于12%SDS-PAGE凝胶中电泳，免疫印迹法WesternBlot检测重组蛋白与WSSV囊膜蛋白VP28的结合。结果如图3,不加蛋白和加入标签蛋白的对照组中（泳道2、3，未检测到VP28信号，而阳性对照Input泳道1和加入rCq-Nslabp重组蛋白（rCq-Nslabp-BTB、rCq-Nslabp-Kelch、;rCq-Nslabp-Full-length的实验组中（泳道4、5、6，能检测到VP28信号。该结果说明rCq-Nslabp重组蛋白的N端、C端结构域及全长重组蛋白均能识别WSSV的囊膜蛋白，且全长蛋白的识别结合能力最强。[0077]实施例4WesternBlot实验验证口1118；[11转染1^-他]^口重组蛋白抑制¥33¥感染复制的作用[0078]rCq-Nslabp重组蛋白抗WSSV活性鉴定:分离螯虾Hpt细胞培养于96孔板中，分别稀释300ng重组蛋白（MBP、rCq_Nslabp-BTB、rCq_Nslabp-KeIch、rCq_NsIabp-Full-length于20ulHEPES溶液中，各加Iulpulsin蛋白转染试剂control组中仅加pulsin，不加任何蛋白），室温孵育15min后加入到96孔板Hpt培养细胞中。26°C培养箱孵育4h后去除原培养基，更换新鲜培养基，并加入WSSV进行感染（MOI=I，24h后收集细胞，加10μ11*SDSsamplebuffer裂解细胞，提取细胞总蛋白，进行WesternBlot分析。[0079]结果如图4,转染了rCq-Nslabp重组蛋白的细胞3、4、5泳道）中，WSSV的主要囊膜蛋白VP28的表达量较对照组（1、2泳道）显著减少，说明转染rCq-NsIabp重组蛋白后WSSV的感染复制作用受到明显抑制，说明rCq-NsIabp具有较强的抗WSSV感染活性。[0080]本发明旨在获得红螯螯虾rCq-Nslabp基因及氨基酸序列，并对其基因工程产品抗WSSV病毒活性进行了鉴定，以期用于高效抗WSSV新药物的开发。本发明成功构建了红螯螯虾抗WSSV感染调控因子rCq-Nslabp基因工程表达重组质粒pMal-C2x-Cq-Nslabp-BTB、pMal_C2x_Cq-NsIabp-KeIch及pMal_C2x_Cq-Nslabp-Ful1-length，在获得rCq-NsIabp重组表达蛋白纯品后，进一步确认了rCq-NsIabp识别及抗WSSV病毒活性，为其作为抗WSSV病害防治新药物的开发奠定了良好基础。

权利要求：I.红螯螯虾抗WSSV感染调控因子的基因序列为：2.红螯螯虾抗WSSV感染调控因子的氨基酸序列为：3.红螯螯虾抗WSSV感染调控因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1将Cq-Nslabp基因连接到原核表达载体pMal_C2x中，构建红螯螯虾抗WSSV感染调控因子pMal-C2x-Cq_NsIabp重组表达载体;所述Cq-NsIabp基因产物包含N端BTB结构域和C端Kelch结构域蛋白及全长蛋白；2将步骤1所得重组表达载转化体分别导入宿主细胞E.coliBL21:DE3，并进行诱导表达，得表达产物；3分离纯化步骤2得到的表达产物，通过亲和层析获得较高纯度的rCq-Nslabp重组蛋白。4.如权利要求3所述红螯螯虾抗WSSV感染调控因子的制备方法，其特征在于在步骤2中，所述诱导表达的条件为〇.ImM硫代半乳糖苷、诱导温度16°C、诱导时间20h。5.如权利要求3所述红螯螯虾抗WSSV感染调控因子的制备方法，其特征在于在步骤3中，所述rCq-NsIabp重组蛋白包括rCq-Nslabp-BTB、rCq-NsIabp-KeIch及rCq-NsIabp-Full-Iength06.如权利要求3所述制备方法所制备的红螯螯虾抗WSSV感染调控因子在制备抗病毒感染药物和动物抗病饲料添加剂中应用。

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