申请/专利权人：福建农林大学

申请日：2018-12-05

公开（公告）日：2019-02-22

公开（公告）号：CN109370953A

主分类号：C12N1/20(2006.01)I

分类号：C12N1/20(2006.01)I;A01G31/00(2018.01)I;A01G7/06(2006.01)I;C12R1/01(2006.01)N

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2021.11.12#未缴年费专利权终止;2019.03.19#实质审查的生效;2019.02.22#公开

摘要：本发明公开了一种根瘤菌JYN6及其应用，属于微生物技术领域。该菌株是从决明属牧草新鲜根瘤中分离和纯化，PCR检测nodA gene，并经16S rDNA分子生物学鉴定所得，确定为慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）的新菌株系，并命名为安羽1号。于2018年4月10日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018192。本发明的根瘤菌JYN6通过实验室盆栽回接试验证明其具有高效结瘤和固氮能力强的特性，接种该根瘤菌能够显著提高决明属牧草的根瘤数、根瘤固氮效率、生物量和植株氮含量，进而达到培肥地力和改善生态环境的效果。

主权项：1.一株决明属根瘤菌 JYN6，其特征在于：所述根瘤菌（Bradyrhizobiumsp.）JYN6，是从决明属牧草新鲜根瘤中分离和纯化，PCR 检测 nodA gene，并经16S rDNA 分子生物学鉴定所得，于 2018 年 4 月10 日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M2018192。

全文数据：一株决明属根瘤菌JYN6及其应用技术领域本发明属于微生物领域，具体涉及一株决明属根瘤菌JYN6及其应用。背景技术我国约有5690万hm2酸性土壤，占总耕地面积42.2%以上。近年来，随着大量化学氮肥的施用，土壤酸化日趋严重。我国酸性土壤主要集中在长江以南地区，该地区光、热、水等资源丰富，但土壤瘦瘠、粘重、pH值低及养分有效性低，严重制约了该地区农业的快速发展。在生产上，往往通过施用大量化肥来提高作物产量。但是大量化肥的投入不仅会导致土壤板结及进一步酸化，而且还会造成水体富营养化和地下水的污染，严重破坏生态环境。通过种植豆科植物结合根瘤菌接种技术，来改良土壤、提高土壤肥力是目前较为认可的一种途径。豆科植物能与根瘤菌结合形成互利互惠的共生关系。根瘤菌从宿主植物得到生长所需的碳水化合物及其他养分，而宿主植物则从根瘤菌生物固氮过程中获取氮素营养，以达到提高农作物产量和降低化肥使用量的效果，进而在减少水土污染的同时保持农业的可持续发展。决明属植物Chamaecristaspp.Greene.是热带、亚热带地区重要的豆科植物，包括乔木、灌木和草本等三类。圆叶决明ChamaecristarotundifoliaPers.Greene原产于澳大利亚，是决明属半直立型多年生豆科草本植物，具有固氮效率高、耐贫瘠、生物量较大、花色艳丽，特别适应酸性土壤等特性。1996年，福建省农业科学院从澳大利亚牧草种质资源中心引进圆叶决明，并将其作为改良酸性土壤的豆科绿肥型牧草，在福建、广东和广西等酸性土壤地区推广种植。但是，圆叶决明在自然条件下结瘤慢且少、固氮效率较低，严重影响其种植及推广应用。因此，为提高圆叶决明的结瘤率和固氮效率，急需筛选出结瘤率高和固氮能力强的根瘤菌菌株，以提高决明属牧草的固氮效率，进而达到培肥地力和改善生态环境的效果。发明内容本发明的目的之一在于提供一株决明属根瘤菌JYN6，该菌株的分类命名为根瘤菌（Bradyrhizobiumsp.）JYN6，是慢生根瘤菌属的新菌株系，于2018年4月10日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018192，保藏地址为：武汉大学。该菌株具有结瘤率高和固氮能力强的特点。本发明的另一个目的是将上述根瘤菌JYN6应用在豆科决明属植物共生固氮中，通过提高圆叶决明的生物固氮能力，促进其生长，达到决明生产中减肥增效的目的。本发明的上述技术目的是通过以下技术方案来实现的：1根瘤菌菌株的分离和纯化1）取羽叶决明新鲜、成熟且个大饱满的根瘤，用水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分；2）放入95%（wv）的酒精中处理3~5分钟，再放入0.1%（wv）HgCl2中，灭菌3~5分钟，取出后用无菌水冲洗5~6次；3）在火焰灭菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向YMA培养基表面划线，倒置后在28℃下培养。YMA培养基的配方如表1所示：表1YMA（YeastMannitolAgar）培养基配方4）待长出菌体后，用枪头从平板上刮取少量根瘤菌菌落，加1mL无菌水稀释后再次于平板上划线培养，3d之后观察菌落情况，一直观察到15d慢生根瘤菌需7~15d出现菌落。如无单克隆菌落出现，则需反复在平板上划线纯化，直到出现单克隆菌落。5）待长出单克隆菌体后，根据以下两个方面判断其是否为根瘤菌：①菌落形态：根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养3~5d菌落直径达2~4mm为快生型根瘤菌，培养7~10d菌落直径为1mm则为慢生型根瘤菌。②nodAgene的PCR检测：挑取上述形态根瘤菌单克隆进行nodAgenePCR检测，引物分别为nodA-F和nodA-R，正向引物SEQIDNO.1：nodA-F5’-TGCRGTGGARDCTRYGCTGGGAAA-3’；反向引物SEQIDNO.2：nodA-R5’-GNCCGTCRTCRAASGTCARGTA-3’。酶选用2×starMix，分别用根瘤菌BXYD3的基因组DNA和水为模板做阳性对照及阴性对照。nodAgene长度为666bp，运用电泳成像技术观察其在666bp处是否具有条带，具有条带的菌落为根瘤菌。其PCR反应体系如表2：表2nodAgene2×starMix酶反应体系反应条件：94℃5min；（94℃30s，55℃30s，72℃1min）×35cycle；70℃5min。2根瘤菌JYN6的性质1形态特征该菌株在菌落形态上，为慢生型，圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多。在YMA平板上生长5~7d后的直径为0.8~2.0mm附图1。2培养特性该菌的最适生长条件为：pH＝7.0，温度28℃，转速180rmin，可利用甘露醇和酵母粉分别作为其碳源和氮源。3基因特性经nodAgenePCR、电泳成像检测，在666bp处具有较亮条带附图2。4功能特性根瘤菌JYN6具有结瘤率高和固氮能力强等特点。菌体被释放到自然环境中，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而丰富了土壤间根瘤菌的群体多样性，对决明属牧草的结瘤固氮具有明显的促进作用。根瘤菌JYN6的16SrDNA分子生物学鉴定为鉴定根瘤菌菌株的系统发育地位，对所分离到的根瘤菌进行16SrDNA的PCR特异性扩增，测序正向引物SEQIDNO.3：V4V5515-F5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；测序反向引物SEQIDNO.4：V4V5907-R5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’；测序所得根瘤菌JYN6的16SrDNA序列如SEQIDNO.5所示；其PCR反应体系如表3：表316SrDNA2×starMix酶反应体系反应条件：95℃5min；（95℃20s，55℃20s，72℃50s）×44cycle；70℃5min。从NCBIGenBank数据库中获取13个参比菌株序列，运用软件BioEdit和MEGA6对分离菌株和参比菌株的16SrDNA部分序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的系统发育树。从而确定根瘤菌JYN6为慢生根瘤菌属Bradyrhizobium的新菌株系附图3，并命名为安羽1号。本发明具有如下有益效果：1本发明的根瘤菌JYN6具有结瘤率高和固氮能力强的特性。回接试验发现，与不接种根瘤菌相比，接种该根瘤菌30d分别提高圆叶决明鲜重和干重161.78wt%和213.49wt%，可用于实际生产；2圆叶决明接种本发明的根瘤菌JYN6，极显著地提高了植株全氮含量P福建农林大学一株决明属根瘤菌JYN6及其应用55PatentInversion3.3124DNAnodA-F1tgcrgtggardctrygctgggaaa24222DNAnodA-Rmisc_feature2..2nisa,c,g,ort2gnccgtcrtcraasgtcargta22319DNAV4V5515-F3gtgccagcmgccgcggtaa19420DNAV4V5907-R4ccgtcaattcctttgagttt205385DNA根瘤菌JYN6的16SrDNA5acaaagcagcgtgctcggatcactgggcgtaagggtgcgtaggcgggtctttaagtcagg60ggtgaaatcctggagctcaactccagaactgcctttgatactgaagatcttgagttcggg120agaggtgagtggaactgcgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcgcaagaacaccag180tggcgaaggcggctcactggcccgatactgacgctgaggcacgaaagcgtggggagcaaa240caggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgccagccgttagtgggtt300tactcactagtggcgcagctaacgctttaagcattccgcctggggagtacggtcgcaaga360ttaaaactcaaaggaaattgacgga385

权利要求：1.一株决明属根瘤菌JYN6，其特征在于：所述根瘤菌（Bradyrhizobiumsp.）JYN6，是从决明属牧草新鲜根瘤中分离和纯化，PCR检测nodAgene，并经16SrDNA分子生物学鉴定所得，于2018年4月10日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018192。2.根据权利要求1所述的一株决明属根瘤菌JYN6，其特征在于：所述PCR检测nodAgene的引物序列，如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的一株决明属根瘤菌JYN6，其特征在于：所述16SrDNA分子生物学鉴定所用引物序列，如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。4.根据权利要求1所述的一株决明属根瘤菌JYN6，其特征在于：所述16SrDNA序列，如SEQIDNO.5所示。5.如权利要求1所述的一株决明属根瘤菌JYN6在豆科决明属植物提高生物固氮能力中的应用。

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