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申请/专利权人：泰克诺瓦克斯股份有限公司

摘要：本申请描述了在其表面展示抗原性副粘病毒如，RSV和或MPV蛋白的病毒样颗粒。还描述了制备和使用这些VLP的方法。

主权项：1.一种病毒样颗粒VLP，其包括：至少一种偏肺病毒MPV结构蛋白；以及至少一种表面MPV或呼吸道合胞病毒RSV蛋白。

全文数据：基于人呼吸道合胞病毒HRSV病毒样颗粒VLPS的疫苗[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请要求2015年08月31日提交的美国临时申请号62212,306的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。[0003]有关联邦资助的研究的声明[0004]本发明部分地得到国立卫生研究院NationalInstituteofHealth的一项或多项资助。美国政府可享有本发明的某些权利。技术领域[0005]本发明涉及包含人呼吸道合胞病毒hRSV病毒样颗粒VLP的组合物、制备和使用这些hRSVVLP的方法，其包括产生和生产基于hRSVVLP的疫苗。具体而言，本公开包括用于开发新型基于VLP的疫苗系统的策略和方法，该系统能保护人类免受不同hRSV血清型A和B型）的感染。本文还描述了生产展示某些优化抗原性构型的VLP和佐剂配方的方法。这些VLP特征性地具有构象表位，所述构象表位与产生增强的中和免疫应答相关。可在已瞬时或稳定转染蛋白质表达载体的真核细胞的悬浮培养物中生产VLP疫苗。VLP在细胞膜组装，并释放到培养基中。经纯化、浓缩和配制之后，可通过适当的途径给予疫苗（例如通过粘膜或胃肠道外途径），并引起能抗hRSV病毒血清型A和B型感染保护的免疫应答。背景技术[0006]人呼吸道合胞病毒RSV导致世界性严重小儿肺病的首要原因。几乎所有婴儿在2岁之前都至少被RSV感染一次。RSV感染的临床谱范围从上呼吸道中的鼻炎覆盖到下呼吸道中的肺炎和支气管炎。全球范围内的流行病学研究显示2-5%RSV感染儿童需要住院，在早产儿中具有最严重的发病率和致死性比例失调影响。RSV疾病每年导致100,000〜200,000例死亡。据信，严重RSV感染会使儿童易于发生喘鸣以及未来疾病和可能的哮喘。重要的是，RSV感染引发中和抗体和T细胞应答，其仅可持续有限的时间段；由此，患者时常对重复感染没有保护能力。并且，老年人在重复感染时显示严重RSV疾病的高风险，其具有很高的致病性和致死率。CDC报道称RSV感染在美国65周岁以上的成人中每年导致177,000例住院和14，000例死亡。[0007]呼吸道合胞病毒是一种单链负义非分段包膜RNA病毒，其被分类为副粘病毒科肺病毒属的一员。病毒基因组（15，522个核苷酸编码11种蛋白质，8种结构蛋白（N、P、M、M2-1、SH、G、F和L以及3种非结构蛋白（NSl、NS2、M2-2。基因组核包含在病毒包膜中，该包膜以M蛋白为主，点缀有二种表面跨I旲糖蛋白G、F和SHc3G蛋白是主要的附着蛋白，而F蛋白则介导膜融合以及随后的复制合胞体形成。RSVA和B亚群间的抗原二态性（antigenicdimorphism主要与G蛋白相关，而F蛋白与这两个亚群之间的关系更紧密。G蛋白和F蛋白包含在受感染宿主中引发部分保护性抗体应答的抗原决定簇。G蛋白上的抗原变化是区分两种RSV亚型A和B的主要决定因素。这两种亚型在人体内循环，可能具有类似的发生率和毒性。F蛋白和G蛋白带有某些CTL表位以及抗原性位点，可引发中和抗体。高效价血清中和抗体防止了下呼吸道的RSV感染，为此提供了作为保护相关性的证据。此外，市售预防性Mb帕丽珠单抗靶向高度保守F蛋白中的中和表位。这些数据提供了选择这些RSV表面抗原作为待掺入VLP疫苗表面上的目标物的理由。并且，展示在病毒体表面上的F蛋白迅速改变构象，由融合前亚稳态形式改变为更为稳定的融合后结构。近期研究显示融合前构象具有瞬时表位，与融合后结构所引发出的抗体相比，其能引发出具有更高中和力度的抗体。这些数据为疫苗开发提供了新视角。RSVVLP描述于例如美国专利公开号20080233150和20110097358中。[0008]尽管经过了超过50年的研究努力，目前还没有用于控制或防止RSV感染的可用获批疫苗。事实上，RSV疫苗开发已因在1960年代进行的一期临床试验中的有害结果而被限制，该试验中涉及使用臭名昭著的甲醛灭活RSV疫苗FI-RSV批号100。给予儿童FI-RSV疫苗导致了RSV自然感染后的疫苗增强性疾病，并造成了80%比例的住院病例以及2例死亡。目前，对于RSV仅能获得的药理学干预是用针对RSV融合糖蛋白（F的中和单克隆抗体帕丽珠单抗Synagis，MedImmune公司进行免疫预防。但是，帕丽珠单抗预防仅限于高风险的婴儿，且其对于发展中国家患者而言成本过高。[0009]疫苗学研究显示F糖蛋白似乎是用于引发抗病毒中和抗体的最具有吸引力的靶标。F蛋白在不同RSV分离株之间具有氨基酸序列高度保守性，其位于病毒体的表面，在通过触发病毒体向靶细胞膜融合进行的病毒进入过程中起到关键作用。重要的是，F病毒还决定肺上皮中RSV感染的典型组织学表现，包括伴随细胞病变效果CPE的合胞体形成。结构和基因研究显示RSVF在宿主中成熟，并组装成膜锚定的同三聚体。并且，RSVF蛋白聚体前体FO是在高尔基体中通过弗林蛋白酶在位点I和II上的切割翻译后活化。该切割过程产生两个亚基，Fl和F2，它们通过两个二硫键半胱氨酸-半胱氨酸桥连接，并释放被称为p27的27个氨基酸的短糖蛋白。因此，Fl亚基的N末端暴露出疏水融合肽FP，其在插入靶标膜中以后引发病毒体-细胞融合。RSVFl的C末端包含细胞溶质尾部CT结构域，在病毒体组装期间该结构域与基质蛋白（M相互作用。[0010]RSVF在具有独特抗原性的不同构象间动态折叠：即高度稳定的融合后形式和亚稳态的融合前形式。Magro及其同事见本专利申请末尾的参考文献26已证实了融合前F蛋白与融合后结构相比能在人和兔中刺激产生中和活性更高的抗体。随后，McLellan及其同事25通过X射线晶体学确定了融合前F蛋白的蛋白质，结构，并鉴别了仅存在于融合前的抗原性位点Φ，该位点在F蛋白的融合后结构中不存在。虽然帕丽珠单抗能识别融合后和融合前结构，高度中和性抗体亚类，如5C4、AM22和D25能与融合前抗原性位点φ特异性相互作用。有趣的是AM14和ΜΡΕ8中和抗体也能利用其他的抗原性位点非常有效地识别融合前F蛋白。这证明了融合前F蛋白表达适于靶向治疗的多个表位，而这些表位在融合后构象中并不展示。[0011]目前并无用于控制、抵御或防止hRSV感染的获批疫苗或特定治疗。通过接种疫苗防止感染代表了具有全球重要性的迫切但未能满足的医疗需求。HRSV疫苗正通过常规策略开发。然而，灭活病毒疫苗在患者中引发了疫苗增强性疾病（13,14,15。采用RSV活减毒疫苗候选物的临床试验始于1976年。该方法的经历提出了达到疫苗减毒和免疫原性之间平衡的警告。采用中度减毒疫苗的在先尝试伴有相关的副作用，例如鼻充血、发烧、肺炎、咳嗽和中耳炎。而另一方面，发现经较强水平病毒减毒的疫苗没有效果。[0012]如本文所述的VLP疫苗在真核细胞中通过某些病毒基因的重组表达产生。获批的VLP疫苗已被证实有效、非常安全且对病毒性疾病例如乙型肝炎病毒HBV、乳头瘤病毒HPV和戊肝病毒HEV有很好的耐受性。之前测试用于hRSV的亚基疫苗采用融合后构象的F蛋白配制。然而，更近的研究证明了融合前构象的F蛋白具有引发优异水平中和抗体的能力。[0013]我们的RSVVLP疫苗包含且展示F糖蛋白的不同构象融合后和融合前），其采用人偏肺病毒hMPV的基质蛋白（M组装。该蛋白质与质膜联合，在病毒体包膜的内小叶（innerleaflet下形成壳，与RSV基质具有类似的功能。然而，在病毒样颗粒形态发生的情况下，我们发现hMPVM蛋白驱动组装过程及VLP离开细胞要优于同源RSVM蛋白（数据未示出）。数个报告显示副粘病毒F在颗粒形成中的作用取决于其胞质尾部，该部分与M蛋白相互作用并促进F蛋白掺入到病毒颗粒的表面上。因此，我们将F蛋白的胞质尾部替换为hMPVF蛋白的相似结构域，以增强RSVF蛋白向出芽位置的募集以及同时掺入到VLP表面上。[00M]除了hMPVM蛋白的结构作用以外，该蛋白质还可增强VLP疫苗的免疫原性。hMPVM蛋白与RSVM蛋白具有高度的氨基酸序列同源性63%，其可在体内刺激天然免疫应答，且具有增强体液和细胞免疫应答的能力。在用RSV感染后的动物中测试这些VLP疫苗显示这些疫苗能诱导有效的免疫应答，从而抑制病毒引起的肺部感染。[0015]因此，需要开发安全和更有效的hRSV疫苗的新技术。[0016]发明概述[0017]本文描述了包含至少一个抗原性RSV蛋白的病毒样颗粒VLP。还描述了包含这些VLP的组合物，以及制备和使用这些VLP的方法。本文所述的VLP是不含病毒遗传物质，由此不能复制或引起感染;然而，由于它们与野生型病毒体在形态学、生物化学和抗原性上的相似性，VLP的免疫原性高且能引发有力的保护性免疫应答。与基于灭活病毒体的疫苗不同，VLP并无传染性，消除了对化学处理的需要，由此保持了组分结构性和或抗原性表位）的天然构象。[0018]因此，本发明描述了一种开发RSV病毒样颗粒VLP的新途径。具体而言，我们描述了针对RSV的VLP疫苗的创造、开发和生产，该疫苗在免疫人类时将引发强烈且平衡的免疫应答，该应答具有诱导抗hRSVA和或B血清型（同时包括A和B血清型）的高水平中和抗体。[0019]基于副粘病毒亚病毒颗粒的研究以及我们自己在VLP组装中的经验，我们设计了用于形成和释放hRSVVLP的有效新策略。我们发现由人偏肺病毒hMPV共表达重组基因工程化融合糖蛋白（F蛋白）和基质蛋白（M蛋白）引发RSVVLP的组装和生产，将该VLP给予对象时能引发免疫应答，包括诱导中和抗体。在某些实施方式中，VLP展示如，在其表面上具有不同反应性的RSVF蛋白（例如通过识别F蛋白结构特征的单克隆抗体所验证）。如本文所述展示在VLP上的不同F蛋白构象似乎与在人体中引发有力中和抗体密切相关。[0020]在本发明的一个方面，描述了副粘病毒hRSV和或hMPV病毒样颗粒VLP池称为亚表达颗粒、重组亚病毒颗粒、生物纳米颗粒、纳米粒等），其利用了来自hRSV和ShMPV的结构性F和M重组病毒蛋白。这些VLP能用做抗副粘病毒包括hRSV血清型A和B感染保护的疫苗或免疫原。[0021]因此，本文描述了病毒样颗粒VLP，其包括:至少一个偏肺病毒MPV蛋白（如，人MPVhMPV基质M蛋白；以及，至少一个MPV或呼吸道合胞病毒RSV蛋白（如，一个或多个F蛋白，一个或多个G蛋白和或一个或多个SH蛋白）。蛋白质可为野生型或经修饰，包括但不限于:密码子优化的蛋白质、在一个或多个氨基酸处有修饰突变、缺失、插入的蛋白质和或在一个蛋白质中包含来自不同肺炎病毒的序列的杂合嵌合蛋白（例如，其中F蛋白（如RSV跨膜和或胞质结构域被来自不同肺炎病毒F蛋白的氨基酸序列如MPV所替代的蛋白质）。在某些实施方式中，修饰包括在如下一个或多个残基处的取代：30、32、102、105、145、148、155、290、467、468、106〜109和或133〜136，基于SEQIDN0:l编号（例如，用半胱氨酸C残基取代野生型中的残基）。在任何本文所述的VLP中，所述一个或多个F蛋白可包含融合前F蛋白构型和或融合后F蛋白构型。[0022]本文还提供了DNA构建体，其包含肺炎病毒的病毒蛋白编码序列，该病毒蛋白用于组装本文所述的一种或多种VLP，DNA构建体包含VLP蛋白的编码序列。还提供了一种产生VLP的方法，其包括:在使得宿主细胞产生VLP的条件下例如将宿主细胞培养在25〜37°C的温度范围下），将本文所述的一个或多个DNA构建体引入宿主细胞如，选自下组的真核细胞:哺乳动物、酵母、昆虫、植物、两栖动物和禽类细胞）。还提供了用本文所述的任何方法产生的VLP。[0023]还提供了包含至少一种本文所述的VLP的免疫原性组合物。本文所述的免疫原性组合物还可包含佐剂。[0024]在另一方面中，本文提供了一种在对象（如，人）中产生对一种或多种肺炎病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予该患者有效量的一种或多种本文所述的免疫原性组合物。可通过黏膜、皮内、皮下、肌肉内和或口服来给予免疫原性组合物。在某些方面，接种引起的免疫应答使得该对象可抵御一种或多种肺炎病毒的多个血清型或进化支。[0025]在另一方面中，提供了产生组装本文所述副粘病毒如，hRSVVLP的方法。在某些实施方式中，这些方法和策略包括对用于产生VLP的基因进行突变、缺失和插入。在其他实施方式中，采用了增强颗粒稳定性、形态发生以及从生产细胞中排出的表达条件，例如补充物和条件:原钒酸钠、丙酮酸钠、丙戊酸、山梨糖醇、咖啡因、L-谷氨酰胺、氨基酸、非必需氨基酸、ITSE胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺）、脂质补充剂、蔗糖或葡萄糖、生长因子、CO2浓度等。[0026]还描述了VLP的组装策略，该VLP在其表面上展示VLP中的单构象F蛋白（融合后或融合前或融合后和融合前构象的组合。在某些实施方式中，将具有呈现融合后和融合前构象的不同抗原性位点的VLP组合起来可形成优化的疫苗制剂，该制剂能引发更高的免疫保护并防止能逃避免疫系统的病毒突变体发生。此外，在所选基因修饰的重组蛋白F和M如，RSV或MPVF蛋白和MPVM蛋白）表达后，VLP的生产能在真核细胞的悬浮培养物中达成。可采用瞬时和温度转染将引导蛋白质表达的质粒导入细胞。VLP从生产细胞中释放到培养基中并从其中收集，通过不同生化方法纯化，例如梯度离心、过滤和层析或其组合。[0027]在另一方面中，本文描述了包含不同结构构象副粘病毒如RSV或MPVF蛋白的VLP的形成，所述F蛋白通过采用结构疫苗学和分子生物学技术开发的氨基酸序列修饰产生。这些VLP对识别F蛋白的特定单克隆抗体显示不同的反应性，反映了它们的不同构象。此外，当作为疫苗给予小动物模型时，以不同构象F蛋白生产的VLP能够诱导更强效价的中和抗体。副粘病毒VLP的用途可包括但不限于:疫苗和免疫学应用、作为佐剂、和或免疫调节剂、异源蛋白或小分子的递送载体、以及预防性和治疗性应用。[0028]不同报道已显示副粘病毒F蛋白在颗粒形成中的作用有赖于其胞质尾部，该尾部是与M蛋白相互作用以及将F蛋白掺入报道颗粒中所需。在另一方面中，本文描述了用于表达杂合蛋白的hRSVF构建体的修饰，该杂交蛋白具有来自hMPVF胞质尾部的取代。修饰可允许hRSVF与hMPVM的相互作用，以及形成包含不同结构F蛋白的VLP。[0029]还提供了通过本文所述的任何方法生产的VLP。[0030]因此，本发明包括但不限于以下实施方式：[0031]1.—种副粘病毒病毒样颗粒VLP，其包含来自人呼吸道合胞病毒hRSV的F蛋白，其中，所述副粘病毒用于hRSV。[0032]2.—种副粘病毒病毒样颗粒VLP，其包含来自人RSVhRSV的F蛋白和来自人偏肺病毒hMPV的M蛋白，所述F蛋白和M蛋白在共表达后组装，其中，所述副粘病毒用于hRSV。[0033]3.如2中所述的hRSV病毒样颗粒，其中，所述蛋白由用于hRSVF和hMPVM的独立转录单元产生。[0034]4.一种DNA构建体，其包含优化和或修饰的编码序列，该序列编码用于组装VLP的hRSVF蛋白®enBank:AC083302.1，SEQIDN0:1，且包含氨基酸修饰以诱导融合前构象。[0035]5.如4中所述的DNA构建体，其具有用于产生F2-F1亚基间二硫桥的如下氨基酸取代：[0036]A102C和I148C、或N105C和G145C、或A102C和G145C、或N105C和I148C、或E30C和L467C、或E30C和Y468C、或E30C和V469C、或F32C和L467C、或F32C和Y468C、或F32C和V469C。[0037]6.如4中所述的DNA构建体，其具有弗林蛋白酶位点I突变（R133K、和R135Q、和Rl36H和或弗林蛋白酶位点II突变R106K、和R108H、和R109Q。[0038]7.如4中所述的DNA构建体，其具有5中所描述的氨基酸取代的任何可能的组合加上S155C和S290C取代：例如，A102C和I148C加上S155C和S290C。[0039]8.如4中所述的DNA构建体，其具有5中所描述的氨基酸取代的任何组合加上6中所描述的氨基酸取代：弗林蛋白酶位点I突变R133K、和R135Q、和Rl36H或和弗林蛋白酶位点Π突变（R106K、和R108H、和R109Q。例如：A102C和I148C，加上R133K和R135H和R136Q，加上R106K和R108H和R109Q。[0040]9.如4中所述的DNA构建体，其具有5中所描述的氨基酸取代的任何组合，加上6中所描述的氨基酸取代，加上氨基酸取代S155C和S290C。[0041]10.如4〜9中所述的DNA构建体，其具有被hMPVF的胞质尾部CT和跨膜结构域TD所替代的CT和TD氨基酸序列:氨基酸1-524的hRSVF截短序列连接于氨基酸489-539的hMPVF截短序列（GenBank:AEK26895.1，SEQIDN0:2。如4〜9中所述的DNA构建体，其中仅CT或TM氨基酸序列被等同的hMPVF序列所替换。此类修饰使得包含重组hRSVF和hMPVM蛋白的VLP的形成得到改善。[0042]11.如4〜10中所述的DNA构建体，其与编码肽接头和hMPVM蛋白的序列连接（图1F〇[0043]12.如4〜10中所述的DNA构建体，其胞质尾部CT的截短与肽接头和hMPVM蛋白连接图1F。[0044]13.—种生产包含所选基因产物的VLP的方法，所述方法包括：用包含编码所选基因产物的一个或多个质粒瞬时转染真核细胞，从而使得所述真核细胞产生VLP。改变表达条件以利于保留不稳定的表位。[0045]14.一种生产包含所选基因产物的VLP的方法，所述方法包括:将编码所选基因产物的一个或多个序列稳定整合入真核细胞的基因组，从而使得所述真核细胞产生VLP。[0046]15.如11或12所述的方法，其中所述真核细胞选自下组:哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、两栖动物细胞和鸟类细胞。[0047]16.用11-13中任一项所述的方法产生的VLP。[0048]17.—种基于VLP的疫苗，其仅用hRSV融合后F且用或不用hMPVM配制。[0049]18.—种基于VLP的疫苗，其用hRSV融合前F且用或不用hMPVM配制。[0050]19.—种基于VLP的疫苗，其用hRSV融合后和融合前F、用或不用hMPVM配制。[0051]20.如15〜17所述的VLP疫苗，其配制使用了佐剂。[0052]根据本文所揭示的内容，这些以及其他实施方式是显而易见。[0053]附图简述[0054]图IA〜IG描述了采用结构疫苗学对RSVF构建体进行的结构开发。图IA是野生型WTRSVF初级结构的示意图（上图）。该RSVF蛋白如下成熟:通过弗林蛋白酶在位点I和II的切割产生F2-F1蛋白聚体并释放p27糖肽。RSVF蛋白的特征是:七次重复结构域HRA、HRB和HRC，融合肽FP，跨膜结构域TM和胞质尾部CT，其对于与基质M蛋白的病毒组装是重要的。F蛋白引发的中和抗体能识别如下抗原性位点：Φ、Ι、ΙΙ和IV。还显示了融合后杂交构建体（“后（中图）和融合前杂交构建体（“前（下图）的示意图，融合后杂合构建体具有被替换的CT和ΤΜ、以及hMPV-F类似结构域（中图和下图中“hMPV”下方的最右侧阴影条），融合前杂交构建体具有位于102-148和155-290之间一个或多个残基的氨基酸二硫键修饰。图IB是融合后和融合前构象的F蛋白聚体的三维结构图。用阴影椭圆指示A102C和I148C半胱氨酸修饰。融合前构象通过形成F2和Fl链之间的半胱氨酸连接而形成。图IC是显示了点印迹分析结果的图，该结果证明了重组F蛋白的免疫反应性。该图表示对5C4—种特异于仅融合前抗原位点Φ希腊字母Phi的小鼠单克隆抗体mAb3个独立试验的结果，相对于帕丽珠单抗的免疫反应标准化：星号表示融合后和融合前条件之间的统计学上显著性P-值P〈0.05;ND表示未检测到。下方所包括的是单点印迹试验图。图ID描述了所选用于病毒样颗粒VLP的人呼吸道合胞病毒hRSV融合蛋白（F和人偏肺病毒基质蛋白（M基因的组装以及它们在表达载体中的不同结构。图IE显示了为诱导融合前构象对hRSVF进行的不同修饰。图IF显示与hMPVM连接的hRSVF。图IG显示了单个VLP的抗原性组合物，以及配制具有不同hRSVF构象的疫苗组合的不同选择。[0055]图2A〜2D显示了采用重组RSVF和hMPVM的RSVVLP的结构和形态。图2A是RSV病毒颗粒的不意图：指不了F、G、SH、M、P、N和L蛋白，以及基因组负链RNA。图2B显不了米用不同抗体如山羊抗RSV抗体抗RSVGt、帕丽珠单抗和抗hMPVM对RSVVLP的Western印迹分析结果。图2C显示了纯化的RSVVLP经负染色和电子显微镜检测。显微照片显示饰有表面突起或“刺突”（箭头处的球状和不规则颗粒90-100nm，类似于RSV病毒体的形态。图2D显示免疫金标记RSVVLP的电子显微镜照片，该VLP用人化单克隆抗体帕丽珠单抗探测，以与金球体偶联的山羊抗人抗体IOnm显影。金球体检测证明了F蛋白饰于VLP表面。[0056]图3A〜3D显示VLP疫苗抗RSV感染保护。图3A显示在刺激后4天的小鼠肺部中病毒效价的空斑测试分析，该分析显示接种VLP的小鼠中未检测到病毒复制，而在安慰剂对照组则显示高产性的感染;虚线是指检测下限。图3B是显示病毒微中和测试的图，该图显示接种后血清中和抗体的水平。相对于VLP融合前和融合后接种，VLP组合接种统计学上显著地增强了中和抗体。图3C是显示在所指示条件下在接种后和病毒攻击前对血清抗体的测定。图3D为对IgG2a与IgGl比值的分析，证明了VLP组合疫苗诱导了优异的Thl介导的应答。图3A〜3D中的结果是在每种条件下用4只小鼠产生的。[0057]图4A〜4D显示了在所指示条件下在RSV感染后的VLP接种小鼠肺部中的细胞因子应答。图4A显示的Thl介导应答中的如下细胞因子：IFNy左图）、IL-12p40中图）和TNFa右图）。图4B显示Th2介导应答的细胞因子测定，包括IL-4左图）、IL-5中图）和IL-13右图）。图4C显示指示Thl7介导的应答的IL-17左图）和ILl-β右图）分析。图4D显示IL-10细胞因子水平，证明了免疫调节过程发展。结果是在每种条件下用4只小鼠的组在感染后4天时产生的。星号表示试验条件和安慰剂对照间存在统计学上显著差异，“ND”表示未能检测。[0058]图5A〜5D显示RSV感染后VLP接种小鼠肺部中的趋化因子应答。分析包括嗜伊红粒细胞趋化因子（图5A、MCP_1图5B、MIF-la图5C和RANTES图5D。结果是在每种条件下用4只小鼠的组在感染后4天时产生的；星号表示试验条件和安慰剂对照间存在统计学上显著差异。[0059]图6A〜6C显示RSVVLP疫苗在鼠肺中未诱导“疫苗增强性疾病”。图6A显示病毒攻击后4天小鼠肺的苏木精和伊红染色:接种组合疫苗的肺部显微镜检（左图）显示没有或少量肺炎病理学异常。而另一方面，接种FI-RSV疫苗诱导了非常高的血管周围免疫浸润（中图）。纳入了安慰剂对照作为参考右图）。图6B显示了病毒攻击后4天小鼠肺的苏木精和伊红染色切片通过盲评评分的血管周围浸润，该评分范围为0正常）至最高3大量浸润），星号表示接种VLP疫苗与FI-RSV之间存在统计学显著差异。图6C显示在RSV攻击后4天（左图）和7天右图）收集并称重的小鼠肺;星号表示相对于安慰剂对照存在统计学上显著差异p〈0.05〇[0000]图7A〜7C显示用本文所述组合物免疫小鼠。图7A显示融合前F构建体的列表，所示构建体通过突变发生产生，并通过ELISA用不同抗F蛋白抗体进行分析，所用抗体为:融合前抗体5C4、融合后抗体131-2A和抗F抗体帕丽珠单抗Synagis,MedImmune公司）。图7B显示在BALBC小鼠中采用的疫苗接种方案，通过肌肉内注射在第1天和第14天对血清反应阴性小鼠进行免疫。用IXIO6Pfu的RSVA攻击小鼠。通过鼻内途径在第28天给予Long病毒株;在RSV攻击后PC第4天和第7天杀死动物。图7C显示免疫和病毒攻击后的小鼠体重测定结果。根据图7B中所述的方案以及材料和方法部分中所述的内容免疫和感染小鼠。所示结果由每种条件10只小鼠的数据产生。具体实施方式[0061]除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如:Remington’sPharmaceuticalSciences《雷明顿药物科学》），第18版Easton,宾夕法尼亚州：马克出版公司（MackPublishingCompany,1990!MethodsInEnzymology《酶学方法》）（S.CoIowick和N.KapIan编，学术出版社公司（AcademicPress，Inc.;以及，HandbookofExperimentalImmunology免疫学实验手册），第I-IV卷（D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986,布莱克威尔科学出版公司（BlackwellScientificPublications;Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual〈〈分子克隆实验室指南》）（第二版，1989;ShortProtocolsinMolecularBiology《分子生物学简明实验方案》），第4版Ausubel等编，1999,约翰韦利森公司（JohnWileySons;MolecularBiologyTechniques:AnIntensiveLaboratoryCourse《分子生物学技术：详细实验室课程》）（Ream等编，1998,学术出版社（AcademicPress;PCRIntroductiontoBiotechniquesSeries《PCR生物技术系列介绍》），第2版（Newton和Graham编，1997,施普林格出版社（SpringerVerlag;FundamentalVirology《基础病毒学》），第二版FieldsKnipe编，1991，纽约拉文出版社（RavenPress,NewYork。[0062]本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文。[0063]在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包含复数指示物，除非上下文中有明确的另外说明。因此，例如提及“一个种VLP”则包括两种或更多种VLP的混合物。[0064]定义[0065]如本文所用，术语“亚病毒颗粒”、“病毒样颗粒”、“重组亚病毒颗粒”或“VLP”均是指非复制性病毒壳。VLP通常由一种或多种病毒蛋白组成，例如但不限于称为衣壳、包被coat、壳、表面、包膜蛋白或来自这些蛋白质的颗粒形成多肽。若VLP如本文所述的RSV和hMPV—样含有来自细胞的脂质膜，则这些VLP也可描述为“包膜的”，若与蛋白质组装但不含脂质膜则称为“未包膜的”。VLP能在合适表达系统中重组表达蛋白质后自发形成。生产特定VLP的方法在本领域中已知，并在下文中更详尽讨论。重组表达病毒蛋白后，VLP的存在能采用本领域已知的常规技术检测，例如通过电子显微镜、生物物理和免疫学表征等。参见例如，Baker等，Biophys.J.199160:1445-1456;Hagensee等，J·Virol·199468:4503-4505。例如，可通过密度梯度离心分离VLP和或通过特征性密度条带鉴别VLP。或者，能在待测VLP制品的玻璃化水性样品上进行冷冻电子显微检测，并且在合适的曝光条件下记录图像。VLP纯化的其他方法包括但不限于色谱技术，例如亲和色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和反相操作。[0066]衍生自特定病毒蛋白的“颗粒形成多肽”是指全长或近全长病毒蛋白，及其片段，或具有内部缺失的病毒蛋白，其在有利于VLP形成的条件下有能力形成VLP。因此，所述多肽可以包含参照分子的全长序列、片段、截短的和部分序列，以及类似物和前体形式。由此，该术语包括序列的缺失、添加和取代，只要该多肽保持形成VLP的能力。因此，该术语包含了特定多肽的天然变化形式，这是因为包衣蛋白的变化常会在病毒分离株中发生。该术语还包括在参考蛋白中非天然发生的缺失、添加和取代，只要该多肽保持形成VLP的能力。优选的取代如下：在自然中保守，即那些取代在侧链相关的氨基酸组中进行。具体而言，氨基酸通常分为四组：（1酸性一一天冬氨酸和谷氨酸；（2碱性一一赖氨酸、精氨酸、组氨酸；（3非极性一一丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;和⑷不带电、极性氨基酸一一甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起归类为芳族氨基酸。[0067]“抗原”是指包含一个或多个表位的分子线性、具有构象或两者），其能刺激宿主免疫系统产生体液和或细胞抗原特异性应答。该术语可与术语“免疫原”互换使用。通常，B细胞表位包含至少约5个氨基酸，但可以小到3-4个氨基酸。T细胞表位如细胞毒性T淋巴细胞CTL表位包含至少约7-9个氨基酸，而辅助T细胞表位包含至少约12-20个氨基酸。通常，表位包含约7-15个氨基酸，例如9、10、12或15个氨基酸。该术语包括与天然序列相比含有修饰例如缺失、添加和取代通常在自然中保守）的多肽，只要该蛋白质保持其引发免疫应答的能力（如本文所述）。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或者可以是意外的，例如通过产抗原宿主的突变。[0068]对抗原或组合物的“免疫应答”是在对象中发展对所关注组合物内所存在抗原的体液和或细胞免疫反应。出于本发明的目的，“体液免疫应答”指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”则是T-淋巴细胞和或其它白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面涉及细胞毒性T淋巴细胞（“CTL”）的抗原特异性应答。CTL有针对肽抗原的特异性，所述肽抗原与主要组织相容性复合体MHC编码并在细胞表面表达的蛋白质关联呈递。CTL帮助诱导并促进消灭胞内微生物或被这类微生物感染的细胞的裂解。细胞免疫的另一方面涉及通过辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞所起作用是帮助刺激非特异性效应细胞的功能并集中其活性，所述细胞针对在其表面展示MHC分子相关肽抗原的细胞。“细胞免疫应答”也指由活化的T-细胞和或其他白细胞包括CD4+和CD8+T细胞所衍生的那些细胞产生细胞因子、趋化因子和其他此类分子。因此，免疫应答可包括如下一种或多种效果：由B-细胞产生抗体;和或特异性针对抗原或所关注组合物或疫苗中的抗原的抑制T-细胞和或γAT-细胞的活化。这些应答可用于中和传染性和或介导抗体-补体或抗体依赖性细胞毒性ADCC来为经免疫的宿主提供保护。这些应答能用本领域中熟知的标准免疫测试和中和测试测定。[0069]“免疫原性组合物”是包含抗原性分子的组合物，其中给予对象该组合物引起该对象中发展出对所关注抗原性分子的体液和或细胞免疫应答。[0070]“基本纯化”通常指物质化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多肽组合物的分离，从而所述物质在包含该物质的样品中占主要百分比。通常，在样品中，基本纯化的组分占样品的50%，优选80%-85%，更优选90-95%。纯化所关注多核苷酸和多肽的技术为本领域熟知，并且包含例如离子交换层析、亲和层析和密度沉降。[0071]“编码序列”或“编码”选定多肽的序列是在合适调节序列（或“控制元件”）控制下时，体内转录DNA情况中）和翻译mRNA情况中）成多肽的核酸分子。编码序列的边界由5’氨基末端的起始密码子和3’（羧基末端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于:来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列，和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3’端。[0072]通常“控制元件”包括但不限于:转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、聚腺苷酸化序列位于翻译终止密码子的3'端）、翻译起始优化序列位于编码序列的5'端和翻译终止序列、和或控制开放染色质结构的序列元件，参见例如McCaughan等，（1995PNASUSA92:5431-5435;Kochetov等，（1998FEBSLetts.440:351-355〇[0073]“核酸”分子可包括但不限于：原核序列、真核mRNA、来自真核mRNA的cDNA、来自真核如哺乳动物DNA的基因组DNA序列、甚至于合成DNA序列。该术语也涵盖包含DNA与RNA的任何已知碱基类似物的序列。[0074]“可操作性连接”指一种元件排列方式，其中所描述的组成部分配置为能行使其常见功能。因此，可操作性连接到编码序列的给定启动子在活化时能影响该编码序列的表达。启动子可不必与编码序列毗连，只要其发挥指导编码序列表达的功能。因此，例如，间插非翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间，而仍可认为该启动子序列“可操作性连接”于该编码序列。[0075]本文用“重组”来描述核酸分子是指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸由于其来源或操作而：（1与其天然相关联的多核苷酸部分或全部不再相关联;和或2连接于并未与其天然连接的其他多核苷酸。与蛋白或多肽联用时，术语“重组”指由重组多核苷酸表达产生的多肽。在表示作为单细胞单位培养的原核微生物或真核细胞系的术语“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和其他此类术语可互换使用，是指能用作或者已经用作重组载体或其他转移DNA的接受体的细胞，且包含已转染的原始细胞的后代。应理解，由于偶然或有意突变，单个亲本细胞的后代可能不必在形态上或基因组或总DNA互补中与原始亲本完全相同。与亲本细胞在相关特性的特征上例如编码所需肽的核苷酸序列的存在足够相似的亲本细胞后代，也包含在本定义所述的后代中，且被以上术语所涵盖。[0076]确定氨基酸序列“相似性”的技术在本领域中是熟知的。总体而言，“相似性”是指两条或更多条多肽在适当位置处其中氨基酸相同或具有相似化学和或生理特性，如电荷或疏水性的氨基酸与氨基酸的确切比较。所谓“相似性百分比”则可在对比的多肽序列间确定。测定核酸和氨基酸序列相同性的技术在本领域中也是熟知的，包括确定该基因的mRNA核苷酸序列通常通过cDNA中间体和确定由其编码的氨基酸序列，并将此与第二条氨基酸序列进行比较。“相同性”通常指两条多核苷酸或多肽序列相应的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的确切一致性。[0077]可比较两条或更多条多核苷酸序列以确定它们的“相同性百分比”。可比较两条或更多条氨基酸序列以确定它们的“相同性百分比”。两条序列的相同性百分比（核酸或肽序列通常描述为两条比对序列的确切匹配数除以较短序列的长度再乘以100。核酸序列的近似比对用Smith和WatermanAdvancesinAppliedMathe-matics《应用数学发展》），2:482-4891981的局部同源算法提供。该算法能扩展用于肽序列，采用DayhofT开发的评分矩阵（AtlasofProteinSequencesandStruc_ture《蛋白质序列和结构作图》），Μ·0·Dayhoff编，增刊5，3:353-358，美国D·C·华盛顿的国家生物医学研究基金会NationalBiomedicalResearchFoundation，并用Gribskov所述方法（Nucl.AcidsRes.l46:6745-67631986标准化。用于计算序列间相同性或相似性百分比的合适程序是本领域中公知的。[0078]“载体”能将基因序列转移到靶细胞如细菌质粒载体、病毒载体、非病毒载体、特定运载体和脂质体）。“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”通常指能在宿主细胞中指导所关注的一个或多个序列表达的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。该术语可与术语“核酸表达载体”和“表达盒”互换使用。[0079]“对象”指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于:人和其他灵长类动物，包括非人灵长类动物如黑猩猩和其他猿和猴种;家畜如牛、绵羊、猪、山羊和马;家养哺乳动物如狗和猫;实验室动物，包括啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家养、野生和猎鸟，如鸡、火鸡和其他鹑鸡类禽、鸭、鹅等。该术语不表示特定年龄。因此，旨在覆盖成年和新生个体。上述系统旨在用于任一上述脊椎动物，因为所有这些脊椎动物的免疫系统运作相似。[0080]“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”指在生物学或其它方面没有不良影响的材料，即可将该材料在制剂或组合物中给予个体而不引起任何不可接受的生物学作用或不与含该材料的组合物中任何成分发生有害的相互作用。[0081]如本文所用，“治疗”指以下任一：（i就传统疫苗而言，防止传染或再传染，（ii减少或消除症状，和（iii基本或完全消灭所讨论的病原体。可预防性感染前和治疗性感染后实现治疗。[0082]如本文所用，术语“佐剂”是指当在制剂中与特定免疫原如VLP组合使用时，能增强或改变或改良所产生的免疫应答的化合物。对免疫应答的改良包括强化或扩大抗体和细胞免疫应答中的一者或两者的特异性。对免疫应答的改良也可指降低或抑制特定抗原-特异性免疫应答。[0083]如本文所用，“有效量”通常是指本发明VLP的量足以诱导免疫力以防止和或缓解感染或降低至少一种感染症状和或增强另一剂VLP的效力。有效量可指足以延迟或最小化感染发病的VLP量。有效量也可指在感染治疗或控制中提供治疗性益处的VLP量。此外，有效量是在感染治疗或控制中提供治疗性益处的本发明VLP单独的量或与其他治疗联合的VLP的量。有效剂量还可为足以增强对象如人）自身抵抗后续接触传染物的免疫应答的量。可对免疫力水平进行监测，例如通过测定中和分泌和或血清抗体的量，例如通过空斑中和、补体固定、酶联免疫吸附、或微中和测试。在疫苗的情况下，“有效剂量”是防止疾病和或减少严重症状的剂量。[0084]如本文所用，术语“有效量”是指足以实现所需生物学效果所需的VLP量。组合物的有效量可以是获得所需结果的量，该量可以由本领域技术人员通过常规试验确定。例如，防止、治疗和或缓解感染的有效量可为与本发明VLP接触时引起免疫系统活化从而导致发生抗原特异性免疫应答所需的量。该术语与“足够量”同义。[0085]如本文所用，术语“多价”是指具有抗多型或多株感染物的多个抗原性蛋白或同一抗原蛋白质的不同构象亚稳定）的VLP，所述同一抗原蛋白质天然地从一种构象转变为另一种构象，但在疫苗制剂上下文中，可包含稳定化固定形式的一种构象或两种构象。[0086]如本文所用，术语“免疫刺激物”是指通过身体自身化学信使细胞因子促进免疫应答的化合物。这些分子包括具有免疫刺激、免疫强化和促炎活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，例如干扰素，白介素如11-1、几-2、11^-3、几-4、11^-12、11^-13;生长因子如粒细胞-巨噬细胞GM集落刺激因子CSF;以及其他免疫刺激分子，如巨噬细胞炎症因子、Flt3配体、B7.1;B7.2等。可在本发明VLP的同一制剂中给予免疫刺激分子，或者可单独给予免疫刺激分子。可给予蛋白质或编码蛋白质的表达载体来产生免疫刺激效果。[0087]如本文所用，术语“保护性免疫应答”或“保护性应答”是指由抗感染物抗体介导的防止或缓解感染或减少其至少一种症状的免疫应答，其由脊椎动物如人呈现。本发明的VLP能刺激具有如下作用的抗体的产生:例如中和感染物、阻挡感染物进入细胞、阻挡所述感染物的复制、和或保护宿主细胞免受感染和破坏。该术语还可指针对感染物的T淋巴细胞介导和或其他白细胞介导的、防止或缓解肺炎病毒如RSV感染或减少其至少一种症状的免疫应答，其由脊椎动物如人呈现。[0088]如本文所用，术语“抗原性制剂”或“抗原性组合物”是指在给予脊椎动物如哺乳动物时能诱导免疫应答的制剂。[0089]如本文所用，术语“疫苗”是指包含本发明VLP的制剂，其为能被给予脊椎动物的形式，且诱导保护性免疫应答，该免疫应答足以引起防止和或缓解感染和或减少至少一种感染症状和或增强其他剂VLP的效力的免疫力。通常，疫苗包含常规盐水或缓冲水性溶液介质，其中悬浮或溶解有本发明的组合物。本发明的组合物可方便地以该形式防止、缓解或治疗感染。当导入宿主时，疫苗能引起免疫应答，包括但不限于:产生抗体和或细胞因子和或活化细胞毒性T细胞、抗原递呈细胞、辅助T细胞、树突状细胞和或其他细胞应答。[0090]概述[0091]本发明描述了在尺寸结构、形态学和生化组成上模拟肺炎病毒的生物颗粒例如VLP的形成;然而，这些生物颗粒并不包含病毒基因组的全部组分，由此不会引起感染或疾病。VLP缺乏病毒基因组和缺乏肺炎病毒例如RSV和或MPV传染性，解除了对化学灭活的需要，由此更好地保持了它们的结构、蛋白质构象以及抗原性特征，增强了作为疫苗的免疫原性和强度。这些生物学模拟物被鉴定为病毒样颗粒VLPJLP用包括编码所选蛋白质的病毒基因组区段的遗传信息组装，该遗传信息可包括但不限于结构和或非结构蛋白或蛋白质组合，其具有来自相近病毒（如RSV和hMPV的类似功能。DNA形式的病毒序列能组织在表达单个多肽的单转录单元区段）中，或组织在各自表达一种蛋白质的分离的多个转录单元区段）中。[0092]病毒样颗粒[0093]本文涉及副粘病毒VLP，该VLP在其表面上携带一种或多种修饰的抗原性肺炎病毒蛋白。该VLP单独或与一种或多种其他VLP和或佐剂组合能刺激抗肺炎病毒如RSV感染的免疫应答。[0094]本发明描述了在尺寸结构、形态学和生化组成上模拟天然人呼吸道合胞病毒hRSV和副粘病毒的生物颗粒的形成，由此能引发强烈的免疫应答。然而，它们并不包含病毒基因组的全部组分，由此不会引起感染或疾病。这些生物学模拟物被鉴定为病毒样颗粒VLPJLP用包括编码F蛋白的hRSV基因组区段的基因信息组装，该基因信息中可包括但不限于人偏肺病毒hMPV基质M蛋白和来自副粘病毒的其他蛋白质。如图1所示，DNA形式的病毒序列能将转录单元组织在各自表达单个多肽的多个分离表达载体中，或组织在能同时表达多个转录单元的单个载体中。[0095]用在本文所述VLP中的蛋白质可为野生型或修饰蛋白。修饰包括但不限于取代、缺失和或插入，以及密码子优化。[0096]在某些实施方式中，VLP包括展示在由一种或多种结构蛋白（如hMPV基质蛋白）形成的VLP表面上的RSVF蛋白，其中该一种或多种结构蛋白形成在其上展示抗原性（如F蛋白）的骨架如，环状）。[0097]示例性的野生型F蛋白（RSV如下（SEQIDNO:1所示。弗林蛋白酶切割位点用粗体表示，可被修饰例如取代）的残基加下划线。可被来自其他病毒如hMPVF蛋白）的类似序列代替的胞质尾部跨膜结构域用斜体表示。[0098]野生型RSVFSEQIDN0:1。[0099][0100]本文所用的F蛋白可包括一种或多种修饰。在某些实施方式中，F蛋白经密码子优化和或包括一种或多种氨基酸修饰，基于SEQIDNO:1编号。可修饰的残基如上用下划线表示，例如可产生形成二硫键的半胱氨酸的取代可在一个或多个如下残基处:残基30如，E30C、残基32如，F32C、残基102如，A102C、残基105如，N105C、残基145如，G145C、残基148如，I148C、残基155如，S155C、残基290如，S290C、残基467如，L467C、残基468Y486C、残基469V469C及其组合（如，S155C-S290C1;A102C-I148C;N105C-G145C;N105C-I148C、E30C-L467C、F32C-Y468C、F32C-V469C。可采用两种或更多种不同的突变或其组合例如A102C-I148C伴S155C-S290C。此外，单个VLP可包括不同F蛋白（例如RSV和或MPV杂合等。类似地，具有多个不同F蛋白的多个VLP可如本文所述组合应用。[0101]在本文所述的任何实施方式中，副粘病毒F蛋白可包括对一个或多个弗林蛋白酶切割位点的修饰，基于SEQIDNO:1编号。在某些实施方式中，弗林蛋白酶切割位点RARRSEQIDNO:1的残基106〜109,如上用粗体表示被修饰为KAHQ。在某些实施方式中，弗林蛋白酶切割位点RKRRSEQIDNO:1的残基133〜136，如上用粗体表示被修饰为KKQH。在其他实施方式中，弗林蛋白酶的两个切割位点均被修饰。[0102]在其他实施方式中，用于制备本文所述VLP的副粘病毒F蛋白包含嵌合杂合RSV序列经修饰或野生型）与来自其他病毒的额外序列例如来自其他肺炎病毒）。作为非限制性的例子，用于产生RSVF蛋白的构建体包含hMPV序列（例如在跨膜和或胞质尾部CT区中，参见图1A。[0103]示例性的hMPVF蛋白序列如下GenBankAEK26895.1SEQIDN0:2所示，其中胞质尾部和跨膜区（489〜539用下划线标示。[0104]野生型hMPVF蛋白（SEQIDNO:2:[0105][0106]在某些实施方式中，非RSV序列在VLP表面不展示例如它们形成锚定在VLP骨架中的跨膜结构域和或在VLP内部的结构域）。[0107]本文所述的VLP还包含来自肺炎病毒的基质蛋白，例如hMPV基质蛋白（M。示例性的hMPV基质蛋白如下所不：[0108]偏肺病毒M蛋白的氨基酸序列：UniProtKBSwiss-Prot:Q6WB99·lSEQIDN0:3:[0109][0110]在本发明的一个实施方式中，在表面展示的蛋白质包括如本文所述的一个或多个肺炎病毒F蛋白，其在表达后引导VLP的形成。为了促进组装和从生产细胞中释放这些VLP，例如，hRSV和或hMPVF蛋白可与hMPVM蛋白以及其他来自副粘病毒的重组野生型或修饰的蛋白质共表达，例如与如下蛋白质共表达:核壳体蛋白（N、小疏水蛋白（SH、G蛋白、M2蛋白、L聚合酶蛋白、P蛋白和蛋白质。[0111]在其他实施方式中，蛋白编码区段的排列顺序可以任何顺序颠倒（相对于彼此）。例如，F蛋白（如RSV和或MPV可直接与骨架蛋白（如hMPV以任何顺序遗传相连。[0112]在其他实施方式中，本文所述的VLP和方法可包括改变蛋白质的序列（例如，导致氨基酸修饰的核苷酸序列修饰），其可用于促进生产细胞形成并释放VLP。[0113]VLP的生产[0114]本文所述VLP的生产可通过任何适宜的方法完成，包括但不限于在真核细胞的悬浮培养物中使蛋白编码序列瞬时和或稳定表达，这通常需要连续的细胞培养过程，其后从培养基中收获VLP。如本文所述生产的VLP可采用标准重组技术方便的制备。将编码VLP形成蛋白的多核苷酸导入宿主细胞，当蛋白质在细胞中表达时，它们组装成VLP。[0115]编码形成和或掺入VLP中的分子蛋白质）的多核苷酸序列可采用重组方法获得，例如通过从表达基因的细胞筛选cDNA和基因文库，或通过从已知包含该基因的载体获得该基因。例如，包含天然存在或改变的细胞产物的编码序列的质粒可获自保藏机构，例如美国典型培养物保藏中心A.T.C.C.，弗吉尼亚州玛纳萨斯），或获自市售来源。包含所关注核苷酸序列的质粒可用适当的限制性酶消化，可将包含核苷酸序列的DNA片段插入基因转移载体中（采用标准分子生物学技术）。[0116]或者，可采用标准技术从表达或包含所述序列的细胞获得cDNA序列，例如cDNA或基因组DNA的苯酚提取和PCR。参见例如，Sambrook等，同上，描述用于得到和分离DNA的技术。简而言之，采用寡聚-dT或随机引物用逆转录酶能反转录来自表达所关注基因的细胞的mRNA。然后，可通过PCR并采用互补于所需序列一端或两端的寡核苷酸引物扩增单链cDNA参见美国专利4,683，202、4,683,195和4,800,159,也可参见PCRTechnology!PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification《PCR技术:DNA扩增的原理和应用》），Erlich编），Stockton出版社，1989。[0117]所关注核苷酸序列还可通过合成而不是克隆采用DNA合成仪例如，应用生物系统392型DNA合成仪（AppliedBiosystemsModel392DNASynthesizer，可购自ABI公司，福斯特城，加利福尼亚州）生产。可设计带有所需表达产物的适合密码子的氨基酸序列。将通过标准方法制备的重叠的寡核苷酸组装成全长序列，组装成全长编码序列。参见例如，Edge1981Nature292:756;Nambair等，（1984Science223:1299;Jay等，（1984J.Biol·Chem.259:631。[0118]优选地，用于形成本文所述VLP的序列与天然存在的肺炎病毒多核苷酸序列的序列相同性约为60%〜80%或两者之间的任何数值，包括61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%和79%，更优选地，序列与天然存在的多核苷酸序列的序列相同性约为80%〜100%或两者之间的任何数值，包括81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%。[0119]本文所述的任何序列还可包含额外的序列。例如，为了进一步增强疫苗效力，表达杂合分子并将其掺入亚病毒结构中。这些杂合分子通过在DNA水平将蛋白质基因编码序列与编码佐剂或免疫调节部分的序列连接而产生。在形成亚病毒结构过程中，这些杂合蛋白质掺入颗粒中或掺于颗粒上。将一个或多个多肽免疫调节性多肽例如如下详述的佐剂掺入本文所述的序列掺入VLP能增强效力，由此减少刺激保护性免疫应答所需的抗原量。或者，如下所述，在由本文所述的序列生产得到VLP后，可在含VLP的组合物中包含一种或多种其他分子多肽或小分子）。[0120]这些亚病毒结构不含传染性病毒核酸且无感染性，解除了对化学灭活的需要。无需化学处理保留了天然表位和蛋白质构象，增强了疫苗的免疫原性特性。[0121]本文所述的序列能以任何组合彼此可操作性连接。例如，可采用同一启动子和或不同启动子表达一个或多个序列。如下所述，序列可包含于一个或多个载体上。可用于表达组装入本文所述VLP中的序列的载体的非限制性例子包括:基于病毒的载体（如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒）、杆状病毒载体参见实施例）、质粒载体、非病毒载体、哺乳动物载体、哺乳动物人造染色体如脂质体、微粒运载体等及其组合。表达载体通常包含编码序列和表达控制元件以使编码区在适合宿主中表达。增强子元件也可用于本文以提高哺乳动物构建体的表达水平。[0122]根据标准程序完成疫苗配制，例如如图1和图2所示。[0123]在某些实施方式中，VLP是单价的，即其包含展示于VLP表面上的一种抗原性肺炎病毒例如RSV和或MPVF或G蛋白。在其他实施方式中，VLP是二价或多价的，在VLP表面上展示多种肺炎病毒蛋白（例如RSV和或MPVF、G和或SH。参见例如图2A。[0124]此外，可如下产生组合疫苗:在单个制剂中混合一种致病病毒如RSV和或MPV的单价、二价或多价组合物和另一致病病毒或其他血清型（如另一种RSV血清型或hMPVVLP的组合物。[0125]VLP的应用包括但不限于：产生给予人类时能治疗和或预防肺炎病毒（如RSV、MPV感染的免疫原性疫苗组合物，包括治疗和或防止一种和或多种肺炎病毒进化支抗原性变体或血清型的感染。肺炎病毒VLP可与其他肺炎病毒VLP例如，不同RSV血清型或hMPVVLP等组合使用。本文所述的VLP还能用于诊断和治疗应用中。[0126]用于生产本文所述VLP的合适宿主细胞包括但不限于细菌、哺乳动物、杆状病毒昆虫、酵母、植物和非洲爪蟾细胞。例如，本领域中已知多种哺乳动物细胞系，包括可购自美国典型培养物保藏中心A.T.C.C.，弗吉尼亚州玛纳萨斯的原代细胞以及永生化细胞系，例如但不限于：MDCK、BHK、VER0、MRC-5、WI-38、HT1080、293、293T、RD、C0S-7、CH0、Jurkat、HUT、SUPT、C8166、M0LT4克隆8、MT-2、MT-4、H9、PM1、CEM、骨髓瘤细胞（如SB20细胞）和CEMX174这些细胞系可购自例如A.T.C.C.。[0127]VLP疫苗的免疫原性可受到展示于颗粒表面的E蛋白结构构象的影响。改变发酵过程温度可改变该构象。在一个实施方式中，在低于37°C的发酵标准温度的温度下（31°C±3°C生产VLP。与在37°C生产的VLP相比，在较低温度下生产的VLP疫苗在作为疫苗给药时可诱导更高的中和抗体效价。[0128]可在生产后纯化如本文所述的VLP。从细胞培养基中进行合适的纯化分离）的非限制性的例子包括:在适当条件下的离心和或梯度离心。纯化的其他方法可包括如下的相继步骤:过滤和或色谱法过程，例如离子交换色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱和或疏水相互作用化学法。[0129]表达一种或多种如前所述序列的细胞系能基于本文的记载通过稳定整合一种或多个表达构建为编码VLP蛋白的载体来轻易产生。调节稳定整合的肺炎病毒序列的表达的启动子可为组成型或诱导型。因此，可产生如下的细胞系：其中一种或多种蛋白质稳定整合，从而在将本文所述序列（如杂合蛋白）导入宿主细胞并表达多核苷酸所编码的蛋白质时，形成递呈抗原性糖蛋白的非复制型病毒颗粒。[0130]在某些实施方式中，产生了稳定表达两种或更多种抗原性不同的肺炎病毒如SV蛋白的哺乳动物细胞系。可将蛋白编码序列导入此类细胞系以产生本文所述的VLP。或者，可形成稳定产生结构性蛋白的细胞系，将编码来自所选病毒株血清型进化支的抗原性肺炎病毒如RSV蛋白的编码序列导入该细胞系，从而生产具有所需抗原性糖蛋白的VLP。[0131]可衍生出VLP生产细胞系的亲代细胞系可选自任何如上所述的细胞，包括例如，哺乳动物、昆虫、酵母、细菌细胞系。在优选的实施方式中，细胞系为哺乳动物细胞系（如293、RD、C0S-7、CH0、BHK、MDCK、MDBK、MRC-5、VER0、HT1080和骨髓瘤细胞）。采用哺乳动物细胞生产VLP提供了：（iVLP形成；（ii正确的翻译后修饰糖基化、棕榈酸化和出芽；（iii不存在非哺乳动物细胞污染物；以及iv易于纯化。[0132]除了产生稳定的转染细胞系，肺炎病毒编码序列还可在宿主细胞中瞬时表达。合适的重组表达宿主细胞系统包括但不限于本领域中熟知的：细菌、哺乳动物、杆状病毒昆虫、酵母和非洲爪蟾表达系统。尤其优选的表达系统是哺乳动物细胞系、昆虫和酵母系统。在哺乳动物和其他系统中的表达可通过多种方法完成，例如采用病毒载体的转染或病毒转导，所述病毒载体为例如牛痘、西门利克森林病毒SFV、α病毒如辛德毕斯，委内瑞拉马脑炎病毒VEE、逆转录病毒慢病毒等。[0133]许多适合的表达系统是市售可获得的，包括例如如下表达系统：杆状病毒表达Reilly，P.R·，等，BACULOVIRUSEXPRESSIONVECT0RS:ALABORATORYMANUAL《杆状病毒表达载体：实验室手册》）（1992;Beames,等，BiotechniquesI1:3781991;Pharmingen;Clontech,加州普拉阿托）、痘病毒表达系统（Earl,P.L.，等，〃Expressionofproteinsinmammaliancellsusingvaccinia〃（“用痘病毒在哺乳动物细胞中表达蛋白质”），CurrentProtocolsinMolecularBiology《新编分子生物学实验指南》，（F.M.Ausubel,等编），格林出版联合公司和韦利出版公司，纽约（1991;M〇SS，B.，等，美国专利5，135,855，授权于1992年8月4日）、在细菌中表达Ausubel，F.M.，等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY《分子生物学当代方案》），JohnWileyandSons公司，中部PAMediaPA;Clontech公司）、在酵母中表达（Rosenberg,S.和Tekamp-01son，P·，美国专利RE35，749，授权于1998年3月27日，纳入本文作为参考;Shuster，J.R.，美国专利5，629,203,授权于1997年3月13日，纳入本文作为参考；Gellissen,G·，等，AntonieVanLeeuwenhoek,621-2:79-931992;Romanos，M.A.，等，Yeast86:423-4881992;Goeddel，D.V.,MethodsinEnzymology《酶学方法》）1851990;Guthrie，C,和G·R.Fink,MethodsinEnzymology《酶学方法》）1941991、在哺乳动物中表达Clontech公司;Gibco-BRL公司，新泽西州格岛（GroundIsland，Ν·Υ;例如中华仓鼠卵巢（CHO细胞系（Haynes，J.，等Nuc.Acid.Res.11:687-7061983;1983,Lau，Y.F·，等，Mol.Cell.Biol.4:1469-14751984;Kauf-man，R.J.,MethodsinEnzymology《酶学方法》）中的"Selectionandcoamplificationofheterologousgenesinmammaliancells，〃（“在哺乳动物细胞中选择和共扩增异源基因”），185卷，pp537_566.学术出版社公司AcademicPress,Inc.，加州圣地亚哥（1991、以及在植物细胞中表达植物克隆载体，Clontech实验室公司，加州普拉阿托，以及PharmaciaLKB生物技术公司，新泽西州皮斯卡塔韦（Pistcataway，N.J.;Hood，E.，等，J.Bacterid.168:1291-13011986;Nagel，R.，等，FEMSMicrobiol.Lett.67:3251990;An,等，"BinaryVectors"“双向载体”），以及PlantMolecularBiologyManual《植物分子生物学手册》，A3:1-191988中的其他载体;Miki，B.L.A.，等，pp.249-265,以及PlantDNAInfectiousAgents《植物DNA感染剂》，Hohn,T·，等编，Springer-Verlag公司，奥地利维也纳（1987;PlantMolecularBiology:EssentialTechniques《植物分子生物学：基本技术》，P·G·Jones和J·M·Sutton，纽约，J·WiIey公司，1997;Miglani,Gurbachan,DictionaryofPlantGeneticsandMolecularBiology《植物遗传学和分子生物学词典》，纽约，食品出版社FoodProductsPress,1998;Henry，R.J.，PracticalApplicationsofPlantMolecularBiology《植物分子生物学实践应用》，纽约，ChapmanHall公司，1997。[0134]当表达载体包含编码亚病毒结构所需蛋白质的改变的基因，将疫苗制剂导入宿主细胞并随后以必需水平表达，组装亚病毒结构疫苗并随后从细胞表面释放到培养基中。[0135]根据表达系统和所选宿主，如下产生VLP:在使颗粒形成多肽表达并能形成VLP的条件下，使得用表达载体转化的宿主细胞生长。合适生长条件的选择是本领域技术人员所知的。如果VLP形成并保留在细胞内，可使用化学、物理或机械方法破碎细胞，这些方法裂解了细胞但保持VLP基本完整。这样的方法为本领域技术人员已知并且描述于例如ProteinPurificationApplications:APracticalAp-proach《蛋白纯化应用：实践方法》E.L.V.Harris和S.Angal编，1990。或者，VLP可分泌并从周围的培养基中收获。[0136]然后采用能保持颗粒完整性的方法来分离或基本纯化颗粒，例如通过密度梯度离心（如鹿糖、酒石酸钾或碘克沙醇梯度）、PEG沉淀、粒化pelleting等（见如Kirnbauer等.（1993J.Virol.67:6929-6936以及标准纯化技术包含例如离子交换和凝胶过滤色谱、正切过滤等）。[0137]组合物[0138]如本文所述产生的VLP在给予对象时能用于引发免疫应答。如前所讨论，VLP可包含多种抗原如来自一种或多种肺炎病毒和或特定肺炎病毒如RSV和或MPV的一种或多种病毒株、血清型、进化支或分离株的一种或多种修饰的肺炎病毒抗原）。通常以疫苗组合物的形式将纯化的VLP给予脊椎动物对象。也可使用疫苗组合，此类疫苗包含例如衍生自其他病毒或其他生物体的其他蛋白质和或编码该抗原的基因递送疫苗。[0139]VLP免疫刺激或疫苗组合物可包含各种赋形剂、佐剂、运载体、辅助性物质、调节剂等。免疫刺激组合物可包含足以引发免疫应答的量的VLP抗原。合适的有效量易于由本领域技术人员确定。该量的范围相对较宽，可通过常规试验确定，且通常为约〇.Iyg〜约10或更大mgVLP抗原，更优选约Iyg〜约300ygVLP抗原。[0140]亚病毒结构疫苗从细胞培养基中纯化并与合适的缓冲剂和添加剂一起配制，所述缓冲剂和添加剂为例如:a防腐剂或抗生素;b稳定剂，包括蛋白质或有机化合物;c佐剂或免疫调节剂，其用于增强疫苗的效力和调节疫苗引起的免疫应答体液和细胞）；或d促进疫苗抗原递呈到免疫系统特定细胞的分子。可以冷冻干燥冻干形式制备该疫苗从而为制剂提供合适的储存和最长的保质期。这实现了储备的疫苗在长时期内保持其免疫原性、效价和功效。[0141]在本文所述的组合物中还可选地存在运载体。通常，运载体为本身不诱导产生对接受所述组合物的个体有害的抗体的分子。合适的运载体一般是代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体如油滴或脂质体），和灭活的病毒颗粒。微粒运载体的例子包括衍生自聚丙烯酸甲酯聚合物的那些，以及衍生自聚丙交酯和聚（丙交酯共乙交酯）（称为PLG的微粒。参见例如Jeffery等，Pharm.Res.199310:362-368;McGeeJP，等，JMicroencapsul.142:197-210,1997;0，HaganDT等，VaccineI12:149-54,1993。此类运载体为本领域普通技术人员熟知。[0142]此外，这些运载体可用作免疫刺激剂（“佐剂”）。示例性的佐剂包括但不限于：（1铝盐（明矾），例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；（2水包油乳剂制剂含或不含其他特定免疫刺激剂，例如胞壁肽见下文或细菌细胞壁组分），例如aMF59国际申请公开号WO9014837，含5%鲨烯、0.5%Tween80和0.5%Span85可选地包含各种量的MTP-PE见下文），虽然并不要求用微流化床ModelHOY微流化床Microfluidics公司，马塞诸塞州牛顿）配制成亚微米颗粒，（bSAF，含10%藍稀、0.4%Tween80、5%普流罗尼克封端聚合物L121和thr-MDP见下文），微流化为亚微米乳剂或涡旋产生较大粒径的乳剂，以及cRibi™佐剂系统RASRibiImmunochem公司，蒙大拿州哈密尔顿），含2%藍稀、0.2%Tween80和选自下组的一种或多种细菌细胞壁组分:单磷酰脂质AMPL、海藻糖二霉菌酸酯TDM或细胞壁骨架CWS，优选MPL+CWSDetox;⑶可使用皂甙佐剂，例如Stimulon™.CambridgeBioscience公司，马塞诸塞州伍斯特或由其产生的颗粒，如ISCOM免疫刺激复合物）；（4完全弗氏佐剂CFA和不完全弗氏佐剂IFA;5细胞因子，例如白介素类IL-l、IL-2等）、巨噬细胞集落刺激因子M-CSF、肿瘤坏死因子TNF、β趋化因子MIP、l-a、IjRantes等）；6细菌ADP-核糖基化毒素的脱毒突变，例如霍乱毒素CT、百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定毒素LT，尤其是LT-K63其中用赖氨酸取代第63位的野生型氨基酸）、LT-R72其中用精氨酸取代第72位的野生型氨基酸）、CT-S109其中用丝氨酸取代第109位的野生型氨基酸）以及PT-K9G129其中用赖氨酸取代第9位的野生型氨基酸，用甘氨酸取代第129位的野生型氨基酸）（参见例如国际申请公开号WO9313202和WO9219265;以及⑵用作免疫刺激剂以增强组合物效果的其他物质。[0143]胞壁酰肽包括但不限于:N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺（thr-MDP、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺nor-MDP和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-Γ-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基-乙胺MTP-PE等。[0144]可用于本文的合适免疫调节分子的例子包括如前所述的佐剂以及如下物质：IL-I和IL_2arupiah等（1990J·Immunology144:290-298,Weber等（1987J·Exp.Med·166:1716-1733,Gansbacher等（1990J.Exp.Med.172:1217-1224，和美国专利4,738,927;IL-3和IL-4Tepper等（1989Cell57:503-512,Golumbek等（1991Sci-ence254:713-716和美国专利5,017,691;IL-5和IL-6Brakenhof等（1987J.Immunol.139:4116-4121以及国际申请公开号TO9006370;IL-7美国专利4,965,195;11^-8、11^-9、11^-10、11^-11、几-12和IL-13细胞因子期刊CytokineBulletin,夏刊1994;IL-14和IL-15;a-干扰素Finter等（1991Drugs42:749-765,美国专利4,892,743和4,966,843,国际申请公开号WO8502862，Nagata等（1980Nature284:316_320，Familletti等（1981MethodsinΕηζ·78:387-394,Twu等（1989Proc.NatI.Acad.Sci.USA86:2046-2050,和Faktor等（1990Oncogene5:867-872;β-干扰素（Seif等（1991J.Viro1.65:664-671;γ-干扰素Watanabe等（1989Proc.Natl.Acad.Sci·USA86:9456-9460,Gansbacher等（1990CancerRe-search50:7820-7825,Maio等（1989Can.Immunol·Immunother·30:34-42，和美国专利4,762,791和4,727，138;6-05?美国专利4,999,291和4,810,643;61-05?国际申请公开号TO8504188;肿瘤坏死因子（TNFJayaraman等（1990J.Im_munology144:942-951;CD3Krissanen等（1987Immunogenetics26:258-266;ICAM-1Airman等（1989Nature338:512-514，Simmons等（1988Nature331:624-627;ICAM-2、LFA-l、LFA-3Wallner等1987J·Exp·Med·166:923-932;I型MHC分子、II型MHC分子、B7·1-β2-微球蛋白（Parnes等（1981Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2253-2257;分子伴侣，如钙连接蛋白（calnexin;以及MHC-连接的转运蛋白或其类似物Powis等（1991Nature354:528-531。免疫调节因子还可为这些分子的激动剂、拮抗剂或配体.例如，受体的溶解形式常被用作这些类型因子的拮抗剂，因为其为这些因子本身的改变形式。[0145]编码上述物质的核酸分子以及其使用对本发明有益的其他核酸分子可很容易地各种来源获得，包括例如保藏机构如美国典型培养物保藏中心）、或从市售来源获得例如英国生物技术有限公司BritishBio-TechnologyLimited，英国牛津的考利Cowley。代表性的例子包括:BBG12含编码127个氨基酸成熟蛋白的GM-CSF基因）、BBG6含γ-干扰素编码序列）、A.T.C.C.保藏号39656含TNF编码序列）、A.T.C.C.保藏号20663含α-干扰素编码序列）、A.T.C.C.保藏号31902、31902和39517含β-干扰素编码序列）、A.T.C.C.保藏号67024含白介素-Ib编码序列）、A.T.C.C.保藏号39405、39452、39516、39626和39673含白介素-2编码序列）、A.T.C.C.保藏号59399、59398和67326含白介素-3编码序列）、A.T.C.C.保藏号57592含白介素-4编码序列）、A.T.C.C.保藏号59394和59395含白介素-5编码序列）、以及A.T.C.C.保藏号67153含白介素-6编码序列）。[0146]编码一个或多个上述多肽的质粒可被合适的限制性酶消化，可采用标准分子生物学技术将含有所关注特定基因的DNA片段插入到基因转移载体例如如前所述的表达载体）中。（参见，例如Sambrook等，同上，或Ausubel等编的CurrentProtocolsinMolecularBiology《新编分子生物学实验指南》，格林出版联合公司和韦利出版公司（GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience〇[0147]给药[0148]VLP以及包含这些VLP的组合物可通过各种递送方式给予对象，所述递送方式包括例如：胃肠道外注射如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙），或通过直肠、口腔如片剂、喷雾）、阴道、局部、透皮（参见如W09927961或经皮（参见如W002074244和W002064162、鼻内（参见如W003028760、眼部、耳部、肺部或其它粘膜给药途径和或组合物粉末的吸入。可通过相同或不同的途径给药多个剂量。在优选的实施方式中，这些剂量是鼻内给予的。[0149]可在其他疫苗递送之前、同时或之后给予VLP以及含VLP的组合物）。同时，VLP给予部位可与所给予的其他疫苗组合物的部位相同或不同。[0150]采用VLP组合物的剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量方案是如下的方案:疫苗接种的初级过程可以包含1〜10个单独剂量，然后以保持和或强化免疫应答所需的后续时间间隔给予其他剂量，例如在第1〜4个月的第二剂量，且若需要，在数月后给予一个或多个后续剂量。剂量方案还可至少部分取决于疗法的效力、所用的疫苗递送方式、对象的需求所决定，并有赖于实施者的判断。[0151]本文中提及的所有专利、专利申请和出版物均以参考的方式用全文纳入本文。[0152]尽管出于理解和清楚的目的，本发明通过说明和示例的方式提供了一些细节，但本领域技术人员可理解在不偏离本发明的精神或范围的情况下可实施各种改变和改进。因此，上述说明和实施例不应理解为是限制性的。因此，显然虽然示例性结果是用RSV抗原蛋白获得的，本文的教导可等同地用于其他肺炎病毒。[0153]实施例[0154]实施例1:肺炎病毒VLP的生产[0155]呼吸道合胞病毒RSV是婴儿和儿童严重呼吸道疾病的主要原因，并在年长者和全球性免疫削弱者中成为重要的健康负担。虽然已付出了几十年的研究努力，对于RSV仍然没有获批的疫苗可用。[0156]我们开发了基于病毒样颗粒VLP的RSV疫苗，其由人偏肺病毒基质蛋白（hMPVM作为结构骨架、融合前或融合后构象的RSV融合糖蛋白（F作为其主要表面免疫原组装而成。疫苗由融合前F蛋白、融合后F蛋白或这两种构象的组合组成，并以基于鲨烯的油乳剂作为佐剂。用这些VLP疫苗免疫提供了抗RSV感染的全面保护，在攻击后的小鼠肺部防止了可检测的病毒复制。对肺部细胞因子和趋化因子的分析显示接种VLP主要诱导了IFN-γThl介导的免疫应答的标志物的产生，这是抗病毒保护主要所需。相反，用甲醛灭活的RSVFI-RSV疫苗进行免疫诱导了高水平的免疫介导的应答的Th2和Thl7型细胞因子和炎症趋化因子，还引起了严重的肺部炎症和组织病理学。该VLP疫苗显示这些免疫介导物的有限产生，且并未诱导如采用FI-RSV疫苗所见的严重细支气管炎或血管周围浸润。值得注意的是，对已免疫小鼠的血清分析显示采用融合前和融合后F蛋白的组合配制的VLP疫苗引发最高水平的中和抗体，并增强了Thl介导的免疫应答。[0157]人呼吸道合胞病毒RSV是导致世界性严重小儿肺病的主要原因。几乎所有婴儿在2岁之前都至少被RSV感染一次。全球范围内的流行病学研究显示2〜5%RSV感染儿童需要住院，在早产儿中具有最严重的发病率和致死性比例失调影响。RSV疾病每年在全球导致100，000〜200，000例死亡（1，2。据信，严重RSV感染会使儿童易于发生喘鸣以及未来疾病和潜在哮喘3,4ASV感染引起中和抗体和随时间衰减的T细胞应答，由此患者常常对于再感染无抵抗力（5,6。此外，老年人在再感染时具有发生严重RSV疾病的更高风险7。尽管经过了几十年的研究努力，目前还没有用于控制或防止RSV感染的可用获批疫苗8。疫苗学研究显示F糖蛋白是用于引发抗病毒中和抗体的最具有吸引力的目标。RSV具有不同构象的F蛋白，它们在抗原性上具有差异：高度稳定的融合后形式和亚稳态的融合前形式（9。Magro等（10证实了在预防性人Ig制剂和经免疫兔中的主要中和活性由特异于融合前F蛋白的抗体负责。随后，McLeIIan及其同事⑶通过X射线结晶学确定了融合前F蛋白的蛋白结构，并鉴定了仅融合前具有的抗原性位点φ图1A。虽然帕丽珠单抗能识别融合后和融合前结构，高度中和性抗体5C4、AM22和D25亚组特异性结合于融合前抗原性位点φ9,10。有趣的是，ΑΜ14和ΜΡΕ8中和抗体也能非常高效地识别融合前F蛋白的其他抗原性位点。这证明了融合前F蛋白表达适于靶向治疗的多个表位（11，12，而这些表位在融化后构象中并不展不。[0158]我们组采用结构疫苗学开发了病毒样颗粒VLP疫苗，其含有重组融合后和融合前F蛋白杂合体以及人偏肺病毒hMPV基质蛋白（M。功效研究显示用融合前FVLP、融合后FVLP或两者的组合进行免疫提供了针对RSV病毒攻击的全面保护。重要的是，VLP接种安全有效刺激Thl型细胞因子谱，组合VLP疫苗引发了最高水平的IgG2a抗体和中和活性。[0159]A.材料和方法[0160]结构疫苗学[0161]对RSV融合（FGenBank:AC083302·1和人偏肺病毒基质（MGenBank:ΑΠ25728.1基因进行密码子优化和化学合成BlueHeronBiotech公司，WA。通过蛋白质结构分析，采用Cn3D软件和来自NCBI资源库的数据，设计融合前F突变体9，13。将野生型优化的RSVF亚克隆到表达载体中，并采用QuickChangeII试剂盒Agilent公司，CA和DNA寡聚体（IDT公司，TX进行半胱氨酸取代诱变。采用重组DNA法，将RSVF的胞质尾部CT和跨膜结构域（TM替换为hMPVF类似结构域。将hRSVF序列的氨基酸1〜524GenBank:AC083302.1，SEQIDN0:1连接到hMPVF序列的氨基酸489〜539®enBank:AEK26895.1，SEQIDN0:2。对构建物进行全长测序以质检。[0162]疫苗[0163]RSV病毒样颗粒VLP在瞬时转染VLP蛋白表达质粒的哺乳动物细胞的悬浮培养物中生产。将Expi293F细胞保持在无血清Expi293表达培养基LifeTechnol-ogies公司，CA中。在不同管中进行转染反应，每Iml细胞培养物2.5XIO6个细胞ml中含有I.OygDNA载体、3.0yg25kDa直链聚乙稀亚胺（PEI，Polysciences公司，PA和0·ImlOptiMem。分别以70%和30%的比例转染RSVF和HMPVM质粒。将混合物在室温孵育15分钟，然后加入细胞。转染后48小时，以8，000Xg离心10分钟使培养上清液澄清，采用SW28转子（BeckmanCoulter公司，CA以140,OOOXg超速离心2小时浓缩VLP。将沉淀粒重悬于250μ1含蛋白酶抑制剂（ThermoScientific公司，MA的E缓冲液（250mM蔗糖、IOOmMMgS〇4、IOmMTRISpH7.5中。然后，采用SW40Ti转子通过连续蔗糖梯度（10〜50%以180,000Xg超速离心4小时纯化VLP。收集15〜25%部分的VLP，采用Vivaspin系统IOOkDa截留（Sartorious公司，NY超滤进一步纯化。[0164]用Western印迹法、斑点印迹法和电子显微镜术对VLP进行表征。通过混合每剂各自含有融合前F和融合后F的等量VLP2yg的F含量来制备组合疫苗4yg的总F含量）。采用Rrince等（14描述的方案制备FI-RSV疫苗。最终制剂加入ImjectAlum佐剂（ThermoScientific公司，MA至4mgml的氢氧化错终浓度，然后用PBS1:25稀释用于动物给药。[0165]斑点印迹和Western印迹[0166]采用斑点印迹测试来分析VLP疫苗的免疫反应性和抗原浓度。将1〜5μ1体积的VLP样品吸收入硝酸纤维素15分钟，然后用3%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水溶液（加入0.1%Tween-20，即TBS-Tween封闭1小时。一抗为：帕刚珠单抗（Synagis®，Medlmmune公司，MD、131-2aEMD-Millipore公司，MA、5C49或抗hMVPM抗体^eneTex公司，克隆4821，CA。将偶联于辣根过氧化酶HRP的鼠抗人抗体或羊抗鼠抗体用作二抗。采用ECL底物和数字成像系统FluorChemM系统，ProteinSimple公司，CA进行检测。通过与系列稀释的重组RSVF蛋白标准品（SinoBiological公司，PA比较并用AlphaViewSA成像软件ProteinSimple公司，CA定量，将采用帕丽珠单抗的斑点印迹用于对疫苗中F蛋白含量的定量。Western印迹米用Novex凝胶系统（LifeTechnologies公司，CA和Nupage4-12%Bis_Tris凝胶（LifeTechnologies公司，CA进行Western印迹。[0167]对VLP颗粒的电子显微镜术分析[0168]通过负染色和电子显微镜术Zeiss902TEM，U=80kV来检测VLP颗粒。将5μ1重悬颗粒施加于福尔瓦formvar包被的铜网格FCF300_CuElectronMicrosco-pyScience公司，PA，用2.0%磷钨酸pH7.0染色。如下进行免疫金标记:将5μ1重悬样品施加于福尔瓦包被的网格，在室温（RT孵育5分钟。然后用缓冲液（0.1%FBS的PBS溶液、IOmM甘氨酸、0.01%NaN3洗涤网格5次；用4%多聚甲醛的PBS溶液固定15分钟，并在1%BSA的PBS溶液中封闭30分钟。将样品浮于40μ1帕丽珠单抗Synagis，Medlmmune公司，MD上4°C过夜，其中该单抗以1:1000稀释于0.1%BSA的I3BS溶液+0.01^NaN3缓冲液中。然后将网格置于湿度箱中以防止蒸发。用缓冲液洗涤5次后，将网格于室温下置于一滴与山羊抗人多克隆IgG抗体Abeam，MA偶联的6nm金珠上2小时，其中该抗体以1:3稀释于0.1%BSA的I3BS溶液+0.01%NaN3溶液中。然后用洗涤缓冲液洗涤样品5次，用2.0%磷钨酸pH7.0染色。[0169]病毒生产及滴定[0170]本研究按照BSL-2条规进行。RSVA2病毒株获自ATCC-VR-1540ATCC，VA并用于鼠类攻击、FI-RSV疫苗生产、免疫及病毒测试。根据供应商的方案，在HEp-2细胞ATCCVA，CCL-23中采用含2%胎牛血清FBSLifeTechnologies公司，CA的培养基DMEM增殖RSV。病毒滴定通过采用HEp-2单层的空斑试验进行。用10倍系列稀释的病毒在无血清DMEM培养基（IO4〜IO8稀释范围），对HEp-2细胞感染1小时以进行病毒吸收。然后，将一薄层1%甲基纤维素Sigma-Aldrich公司，M0，C-4888的DMEM培养基溶液补充有2%FBS施加于各孔以防止病毒颗粒扩散。孵育4〜5天后，去除该薄层，用冷甲醇在-20°C固定细胞20分钟。用免疫细胞化学技术以抗RSV山羊抗体EMD-Mi11ipore公司，CA，ABl128对病毒空斑进行染色，其中该抗体以1:500稀释于封闭缓冲液中作为一抗。采用作为二抗的HRP偶联的兔抗山羊抗体AbeamMA公司，ab97105进行免疫检测。用DAB过氧化物酶（HRP底物试剂盒（VectorLaboratories公司，CA，SK-4100使免疫染色显色，采用光学显微镜以4X〜20X的放大倍数对空斑进行计数。[0171]用于免疫和RSV感染的鼠模型[0172]将购自查尔斯河CharlesRiver的6周龄雌性BALBc小鼠（musmusculus置于纽约医科大学的比较医学系中（DepartmentofComparativeMedicine,NewYorkMedicalCollege，瓦尔哈拉Valhalla，NY。在免疫或血液收集前，通过腹膜内注射给予氯胺酮（l〇〇mgkg赛拉嗪（10mgkg麻醉小鼠。肌内（IM注射50μ1融合后疫苗、融合前疫苗或组合VLP疫苗、FI-RSV、安慰剂对照来免疫小鼠（η=10只组）。在第1天和第14天给予免疫，各种VLP疫苗剂量中包含4yg总重组RSVF蛋白，其以1:1的体积比与基于鲨烯的水包油纳米乳剂AddaVaxInvivoGen公司，CA混合。安慰剂组接受以1:1体积比与AddaVax混合的PBS。在免疫之前和之后，通过眼球后采血收集血清。在第28天，通过鼻内途径给予小液滴形式的50μ1IXIO6Pfu的RSVA2病毒株（带超细枪头的自动移液器攻击小鼠。攻击后第4天和第7天成组处死小鼠收集肺部和血液参见图2。[0173]通过空斑试验定量肺部RSV[0174]收集RSV感染小鼠的肺部，称重、用Omni组织匀浆器Omni国际公司）在Opti-EMI培养基含25%蔗糖、青霉素-链霉素-谷氨酰胺LifeTechnologies公司，CA和2.5ygml两性霉素Chem-Impex国际有限公司，IL中匀浆。通过离心获得肺部上清液，用如上所述的空斑试验测定病毒滴度。[0175]中和试验[0176]空斑减少中和试验PRNT采用病毒攻击第28天前收集的血清样品一式两份进行。如前所述，将系列稀释的血清与IOOpfu的RSVA2病毒在37°C孵育1小时，通过HEp-2中的空斑试验测定中和能力。应用概率单位Probit分析计算IC5Q15。[0177]Luminex细胞因子和趋化因子分析[0178]根据生产商说明书，采用MILLIPLEXMAP复合小鼠细胞因子板IEMD-Millipore公司，MA对细胞因子进行基于磁珠的夹心免疫分析。在复孔中用LuminexMagPixLuminex有限公司，TX分析肺部样品（25μ1。细胞因子浓度用LuminexXponent4.2和EMD-MilliporeMilliplex分析软件v5.1采用5-plog分析测定。肺液中的IFNy分析采用ELISA试剂盒eBioscience公司，CA确认。[0179]IgG亚型的ELISA分析[0180]ELISA分析板CorningCostar公司，NY，3912的各孔用含IOOngF蛋白含量通过斑点印迹分析以纯化的重组F蛋白（SinoBiological公司，PA作为标准品测定）的BSVA2病毒株包被，并在4°C孵育过夜参见上文）。在封闭缓冲液5%牛奶的TBS-tween溶液）中系列稀释血清样品，一式三份施加于ELISA板，在室温下孵育2小时。洗涤后，采用如下抗体进行检测：IgGl亚型（Jackson免疫研究实验室公司，PA，115-035-205、IgG2a亚型Jackson免疫研究实验室公司，PA，115-035-206。采用化学发光ECL法和酶标仪BioTek公司，VT，型号SynergyHl进行ELISA测定。根据Frey等（16的描述进行ELISA分析的终点计算。[0181]组织病理学[0182]在感染后第4天收集肺部，在10%缓冲的福尔马林磷酸盐溶液中固定。肺部样品在纽约医科大学的病理系（瓦尔哈拉，NY进行处理，用苏木精和伊红HE根据标准步骤进行染色（17。通过对HE染色切片的盲评进行肺部病理学测定和评分。[0183]统计[0184]采用GraphPadPrisGraphPad软件公司，CA对数据进行统计学分析并作图，误差线表示计算的标准误差。以采用试验条件间的登尼特多重比较（Dunnett’smultiplecomparisons的单向ANOVA测试和t-检验来确定数据的统计学显著性。IgG2a与IgGl的比值分析通过用于计算标准误差的泰勒展开统计方法获得。用AdobePhotoshop软件Adobe，CA显不图片和图像。[0185]实施例2:展示融合后和融合前构象的重组RSVF的开发[0186]对融合后F蛋白的结构分析显示F2的C末端位于Fl的N末端的相对方向并与之远离图1B，而在融合前构象中这些结构域则是邻近的（9，13。我们在该结构域中识别了相距小于10埃的数个邻近氨基酸。基于该分析，我们产生了在这些结构域间具有不同的二硫键以将F蛋白稳定在其融合前构象的9种重组构建体，以及具有弗林蛋白酶切割位点突变的构建体图7。[0187]融合前FVLP在哺乳动物细胞中生产，用帕丽珠单抗的斑点印迹抗原性位点II分析以测定F蛋白表达，用5C4单抗的斑点印迹分析判断抗原性位点φ的存在和稳定性（图7。我们用特异于抗原位点I的131-2a单抗评估了融合后状态（图7。我们发现最稳定的融合前F蛋白包含McLellan等（18所描述的Fl亚基内的链内二硫键S155CS290C，加上半胱氨酸取代A102C和I148C所致的Fl和F2亚基之间的链间二硫键（图IA和1B。通过以5C4进行的斑点印迹分析，我们发现对融合前F重组体的识别是融合后F蛋白的19.2±2.4倍。为了评估二硫桥A102CI148C是否增强了融合前F的稳定性，我们测试了仅具有一个半胱氨酸变化A102C的中间突变体。事实上，A102C突变构建体证实了其与5C4的反应性与野生型F融合后构建体相当。[0188]此外，斑点印迹分析证明了相对于单二硫键构建体，二硫键S155CS290C与A102CI148C的组合增强了5C4反应性（图7。在疫苗研究中采用了用该突变体（S155CS290C加A102CI148C组装的VLP。此外，该F构建体含HMPVF的胞质尾部结构域（图1A，这似乎进一步稳定了掺入颗粒的F蛋白的结构通过与5C4和帕丽珠单抗的强烈反应体现，见图1C。不含HMPVF尾部的该突变体和其他突变体显示与5C4的强反应性，但与帕丽珠单抗的反应性较弱（图7。[0189]实施例3:展示RSVF融合后或融合前构象的VLP[0190]RSV包膜展示3种病毒编码的膜锚定蛋白，S卩F、G和SH蛋白（19。在包膜下方的基质M蛋白在形态发生过程中多聚化并区定病毒体组装和出芽（20。为了组装VLP，我们采用了融合前或融合后的RSVF和作为骨架的人偏肺病毒hMPV基质蛋白（M，我们发现该基质蛋白在VLP形成中比RSVM更有效。为了优化RSVF和hMPVM的相互作用，我们将RSVF蛋白的胞质尾部替换为hMPVF蛋白的类似结构域，这基于与未修饰F相比的产率分析证实的RSVF募集及掺入VLP表面的增强（图1C。[0191]通过Western印迹分析纯化的VLP显示RSVF杂合体与hMPVM共纯化（图2B，且与野生型RSVF相比，替换胞质尾部促进RSVF掺入到颗粒表面上。[0192]这些结构表明RSVF杂合体与hMPVM通过其基因工程化操作的胞质结构域相互作用。通过电子显微镜术EM检测纯化的VLP显示约SOnm直径的球状结构展示从包膜突出的F刺突（图2C和2D。免疫金标记EM确认了这些刺突确实由糖蛋白F组成（图2D。[0193]实施例4:小鼠模型中RSVFVLP疫苗的效力评估[0194]为了测试VLP疫苗的包含效力，用含有如下物质的制剂免疫BALBc小鼠两次，然后用RSV攻击:i融合后FVLP，ii融合前FVLP，或iii两种VLP的组合（图7。为了测试VLP疫苗的安全性，我们加入了用预期会诱导疫苗增强性疾病的FI-RSV疫苗免疫的一组小鼠。在攻击后第4天分析保护效力显示VLP免疫小鼠对RSV复制完全保护，且未显示可检测的病毒负荷30%，而获自VLP接种小鼠的肺部则与安慰剂组没有差异（图6C〇[0205]综上所述，数据证明了用不同构象RSVF糖蛋白构建的基于VLP的新型RSV疫苗的免疫原性、效力和安全性。之前测试的亚单位疫苗主要以融合后构象的RSVF配制35,36。然而，最近的研究（21，22,37已证明融合前构象的RSVF较融合后构象能引发更高水平的中和抗体。事实上，不同组已显示含融合前构象RSVF的疫苗在保护小鼠和棉鼠抗RSV感染中更优异21，22,37。考虑到这些数据，我们设计、生产和测试了在哺乳动物中高表达的新型重组稳定化融合前F蛋白，其被掺入VLP，并被5C4单抗结合仅融合前蛋白具有的抗原性位点φ强烈识别。[0206]虽然VLP是强免疫原，我们在VLP疫苗中包含了佐剂以引起更大的免疫原性。比起天然感染刺激而无法防止再感染的保护，抗RSV的保护可能需要更大的免疫力。我们选择了基于鲨烯的油乳剂，因为其为Thl和Th2介导的免疫力的强诱导剂且具有很好的耐受性和安全性38,39。[0207]对于RSV病毒攻击后通过VLP接种提供的保护效力进行的评估显示三种VLP疫苗制剂各自均保护肺部免受病毒感染。另外，对血清中和效价的评估显示与融合后FVLP疫苗免疫相比，融合前FVLP疫苗诱导的抗体具有更高的中和能力，这与之前的研究相符21，22，虽然程度不同。然而，VLP组合疫苗显示最佳的中和活性，其中和活性大于用融合后VLP疫苗所见的4倍，大于用融合前VLP疫苗所见的2倍。值得注意的是，所有VLP疫苗均含有相同的总F蛋白含量总共4yg，这表明F蛋白两种构象的组合在引发保护性免疫应答中可具有协同性。用新城疫病毒VLP疫苗进行的近期研究显示融合前和融合后形式比较时的相似结果，然而并未测试组合制剂21，40。组合疫苗较其各组分展示更大中和表位库看来是合理的。这一成果对于RSV疫苗开发是重大的，且需要进一步研究来明确其深入的机理。[0208]与抗体中和测试数据一致，IgG同种型分析显示组合疫苗诱导了平衡的Thl介导的免疫应答。另一方面，FI-RSV疫苗引发高水平IgG，这与诱导中和抗体无关。该结果清楚阐释了高抗体滴度与中和能力之间的分歧，这已是FI-RSV疫苗增强性疾病的特点。[0209]细胞因子分析显示与安慰剂相比，所有VLP接种小鼠均产生了统计学上显著水平的IFNy，这与诱导Thl型免疫应答相关。另一方面，FI-RSV疫苗诱导了高水平的IFNy和TNFα、高产量的Th2极化细胞因子（IL-4、IL-5和IL-13、Thl7极化细胞因子（IL-17、IL-I©和IL-10以及趋化因子嗜伊红粒细胞趋化因子、MCP-1、MIF-1α和RANTES，这些都与增强的RSV发病机理相关24-29。相反，VLP接种小鼠产生了低得多量的这些炎性细胞因子和趋化因子。此外，组织病理学研究显示VLP接种并未在肺中诱导不利的免疫细胞浸润，就这方面而言，VLP组合制剂是耐受性最佳的疫苗。[0210]综上所述，我们描述了生产由RSVF糖蛋白构成的RSVVLP，其展示适于引发中和抗体的不同表位。考虑到两种F构象间的差异、中和强度、共同表位及独特表位的分布，比较组合制剂与单一VLP疫苗融合前或融合后F的免疫原性和效力似乎很重要。该研究显示包含了在融合前和融合后F中显示的多种表位的VLP组合疫苗提供了抗RSV的全面保护并引发产生了最高水平的血清中和抗体这与发展强Thl免疫应答相关）。此外，还证实了用该疫苗免疫是安全的，这是任何RSV疫苗候选物所必需满足的条件。我们预期VLP组合疫苗可引发更广的中和抗体谱，由此可提供抗RSV的更佳保护，且是临床评估中可行的安全有效的候选物。[0211]参考文献[0212]l.MengJ1StobartCC1HotardAL1MooreML.Anoverviewofrespiratorysyncyt-ialvirus“呼吸道合胞病毒概述”）.PLoSPathog.2014;10:el004016.doi:10.1371journal.ppat.1004016[0213]2.HalICB,WeinbergGA,IwaneMK,BlumkinAK,EdwardsKM，StaatMA等，Theburdenofrespiratorysyncytialvirusinfectioninyoungchildren“幼儿中的呼吸道合胞病毒感染负担NEnglJMed.2009;360:588-598.doi:10.1056NEJMoa0804877[0214]3.KnudsonCJjVargaSM.Therelationshipbetweenrespiratorysyncytialvirusandasthma“呼吸道合胞病毒与哮喘的关系VetPathol.2015;52:97-106.doi:10.11770300985814520639[0215]4.WuP,HartertTV.Evidenceforacausalrelationshipbetweenrespiratorysyn-cytialvirusinfectionandasthma“呼吸道合胞病毒感染与哮喘间因果关系的证据”）.ExpertRevAntiInfectTher.2011;9:731-745.doi:10.1586eri.l1.92[0216]5.JohnsonKMjBloomHHjMufsonMAjChanockRM.Naturalreinfectionofadultsbyrespiratorysyncytialvirus.Possiblerelationtomildupperrespiratorydisease“成人呼吸道合胞病毒天然再感染中上呼吸道疾病的可能关系”）.NEnglJMed.1962;267:68-72.doi:10.1056NEJM196207122670204[0217]6.FalseyAR,SinghHK,WalshEE.Serumantibodydecayinadultsfollowingnaturalrespiratorysyncytialvirusinfection“成人中天然呼吸道合胞病毒感染后的血清抗体衰减”）.JMedVirol.2006;78:1493-1497.doi:10.1002jmv.20724[0218]7.WalshEEjFalseyAR.Respiratorysyncytialvirusinfectioninadultpopulations“成年人群中的呼吸道合胞病毒感染”）.InfectDisordDrugTargets·2012;12:98-102·[0219]8.SchweonSJ.Respiratorysyncytialvirus:Morethanapediatricinfection“呼吸道合胞病毒:不仅仅是儿科感染”）.NursingLond.2015;45:64-65.doi:10.109701.NURSE.0000463675.37089.95[0220]9.CollinsPLjFearnsRjGrahamBS.Respiratorysyncytialvirus:virology,reversegenetics，andpathogenesisofdisease“呼吸道合胞病毒：病毒学、反向遗传学和疾病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权利要求：1.一种病毒样颗粒VLP，其包括：至少一种偏肺病毒MPV结构蛋白；以及至少一种表面MPV或呼吸道合胞病毒〇?SV蛋白。2.如权利要求1所述的VLP，其中，所述MPV蛋白包含人MPVhMPV基质⑽蛋白。3.如权利要求1或2所述的VLP，其中，所述表面MPV或RSV蛋白包含一个或多个F蛋白、一个或多个G蛋白和或一个或多个SH蛋白。4.如权利要求3所述的VLP，其中，所述一个或多个F蛋白包含融合前F蛋白构型和或融合后F蛋白构型。5.如权利要求1-4中任一项所述的VLP，其中，所述RSV和或MPV蛋白经密码子优化。6.如权利要求1-5中任一项所述的VLP，其中，所述表面蛋白包含对一个或多个氨基酸残基的修饰。7.如权利要求6所述的VLP，其中，所述修饰包括在如下一个或多个残基处的取代:30、32、102、105、145、148、155、290、467、468、106〜109和或133〜136，基于SEQIDN0:l编号。8.如权利要求7所述的VLP，其中，在30、32、102、105、145、148、155、290、467和或468位的一个或多个残基处的取代是用半胱氨酸残基取代野生型残基。9.如权利要求6-8中任一项所述的VLP，其中，所述F蛋白的一个或多个结构域被不同肺炎病毒的结构域替换。10.如权利要求9所述的VLP，其中，所述RSF蛋白的跨膜结构域和或胞质结构域被来自hMPVF蛋白的氨基酸序列替换。11.如权利要求6-9所述的VLP，其中，所述表面蛋白通过连接肽序列连接到所述hMPV基质蛋白。11.一种DNA构建体，其包含用于组装如权利要求1-10中任一项所述VLP的肺炎病毒蛋白的编码序列，所述DNA构建体包含结构和表面蛋白的编码序列。12.—种生产VLP的方法，所述方法包括:在使宿主细胞生产所述VLP的条件下，将如权利要求11所述的一个或多个DNA构建体导入所述宿主细胞。13.如权利要求12所述的方法，其中，所述宿主细胞是选自下组的真核细胞:哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、两栖动物细胞和鸟类细胞。14.如权利要求12或13所述的方法，其中，所述细胞培养于25°C〜37°C的温度范围内。15.用权利要求12-14中任一项所述的方法产生的VLP。16.—种免疫原性组合物，其包含至少一种权利要求1-10或15中任一项所述的VLP。17.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。18.—种在对象中产生对一种或多种肺炎病毒的免疫应答的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的如权利要求16或17所述的免疫原性组合物。19.如权利要求18所述的方法，其中，所述组合物经粘膜、皮内、皮下、肌肉内或口服给予。20.如权利要求18或19所述的方法，其中，所述免疫应答使得所述对象对一种或多种肺炎病毒的多种血清型或进化支获得免疫。21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中，所述对象是人。

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