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申请/专利权人：浙江大学

摘要：本发明公开了EphrinA1在肿瘤发生发展、转移、治疗和患者生存预后中的应用。本发明公开了EphrinA1参与肿瘤的生长、侵袭和转移过程，EphrinA1在胃癌组织中的高表达导致胃癌病人预后不良，靶向敲低或敲除EphrinA1的表达能够显著抑制胃癌细胞的侵袭能力和小鼠体内的转移能力。本发明利用靶向EphrinA1的抗体阻断EphrinA1的功能，能有效抑制胃癌细胞的侵袭能力。本发明发现EphrinA1在肿瘤治疗中具有重要的应用价值，可以作为抗肿瘤药物的靶点。

主权项：1.EphrinA1蛋白在制备用于抑制肿瘤细胞侵袭和或转移的药物中的应用。

全文数据：EphrinA1蛋白在制备用于抑制肿瘤细胞侵袭、转移的药物中的应用技术领域本发明涉及EphrinA1蛋白在制备用于抑制肿瘤细胞侵袭、转移的药物中的应用背景技术2018年最新全球癌症统计数据对全球185个国家36种癌症的发病率和死亡率进行了估算，报告显示，2018年全球新增癌症病例将达到1810万人，死亡病例将达到960万人，癌症预计将成为21世纪死亡的首要原因。在两性中发病率最高的5种癌症分别是肺癌占癌症总发病人数的11.6％、女性乳腺癌11.6％、结直肠癌10.2％、前列腺癌7.1％和胃癌5.7％，死亡率最高的5种癌症分别是肺癌占癌症总死亡人数的18.4％、结直肠癌9.2％、胃癌8.2％、肝癌8.2％和乳腺癌6.6％。这一结果说明全球的癌症负担进一步加重，同时也说明了寻找抗肿瘤关键靶点及其相关治疗手段的研究的重要性和急迫性。肿瘤的发生发展是一个十分复杂的生物学过程。与正常细胞相比，肿瘤细胞具有无限增殖、能量代谢异常、活性氧自由基升高、组织浸润与转移、抵抗细胞死亡等特性。目前多数癌症缺乏早期诊断的方法和有效的治疗手段，尤其是发生转移的病人其预后更差。而癌症转移是一个极其复杂的多步骤的生物学过程，主要包括癌症细胞从原发灶脱离，突破基底膜并进入血液循环或淋巴循环，穿出血管或淋巴管，在特定组织或器官中定植形成微小转移灶，最终增殖形成肉眼可见的转移灶。然而，至今为止，有关癌症发生发展及转移的分子机制依然不明确，寻找抑制肿瘤发生发展和转移的关键靶点至关重要。EphrinsEphfamilyreceptorinteractingproteins家族是迄今所知的最大的受体酪氨酸激酶亚家族RTKsEph的配体。Ephrin配体根据结构不同分为两种亚型：EphrinA亚型共5种，是通过糖基磷酯酰肌醇GPI固定于胞膜上的膜蛋白；EphrinB亚型属于跨膜蛋白，有Eph结合区和短的胞浆区。根据同源性不同，Eph受体分为EphA和EphB两个亚族。Ephrin家族及其受体Eph在动物胚胎发育和组织稳态等过程中发挥重要的调控作用，其功能异常与中枢神经系统疾病和癌症的发生发展密切相关。EphrinA1EFNA1是这个家族中第一个被明确的配体，1990年作为一种被肿瘤坏死因子TNFα诱导的基因，从人脐静脉内皮细胞HUVECs中克隆出来，该基因定位在1号染色体q21-q22位置,分子量约为22KD。EphrinA1最主要的受体为EphA2，在血管新生等过程中扮演不可或缺的角色，其表达异常在促进肿瘤发生黑色素瘤、肝癌、鳞状细胞癌、结肠癌和胃癌等、血管生成和癌症转移等方面发挥重要的作用。EphrinA1在多种恶性肿瘤中表达异常，许多致癌的信号通路都受到EphrinA1的影响，比如MAPERK和PI3K信号通路。一些证据表明，由于EphrinA1本身的复杂性和细胞类型依赖性，在一些类型的细胞或癌症中起到促进肿瘤发生的作用，但在另一些类型的细胞或癌症中可能起到抑制肿瘤进程的作用。研究表明在乳腺癌和胶质瘤中，EphrinA1表达受到抑制。在乳腺癌中EphrinA1与rasMAPK通路有关，主要的机制是EphrinA1的低表达使EphA2的磷酸化减少从而导致下游ras信号的激活，而ras信号的激活又会进一步增加EphA2的表达，抑制EphrinA1的表达，这样形成一个反馈环路，促进肿瘤的进程。在黑色素瘤、膀胱癌，肝癌，卵巢癌等癌症中，EphrinA1和EphA2表达升高，研究表明在卵巢癌中EphrinA1的高表达会导致病人差的预后；在肝癌中EphrinA1能通过调控甲胎蛋白来促进肿瘤细胞的增殖。目前对于EphrinA1在胃癌中研究很少，有证据表明EphrinA1在胃癌中表达上调，但其具体的作用机制尚不清楚，关于EphrinA1作为胃癌治疗潜能的研究目前还尚未有报道。胃癌作为全球最常见的恶性肿瘤之一，是导致癌症死亡的重要因素之一。在全球范围内，胃癌是第五高发病率和第三高死亡率的恶性肿瘤，而中国是胃癌最高发的国家之一。在中国，胃癌的年龄标化发病率和死亡率均居我国恶性肿瘤年龄标化发病率和死亡率的第二位，已经严重危害到人类的健康。但是由于胃癌起病隐匿，又缺乏早期诊断的有效手段，发现时多数患者都处于中晚期，因而预后极差，尤其是发生远端转移的病人，其5年生存率只有5％左右，是晚期胃癌患者死亡的主要原因之一。因此，我们迫切需要深入了解胃癌发生发展和转移的发病机理，寻找调控胃癌细胞发展和转移过程的关键因子。EphrinA1在多种肿瘤中发挥重要的作用，提示EphrinA1可能作为胃癌进展和转移的预后因子和治疗靶点。发明内容本发明的目的是针对现有技术的不足，提供EphrinA1蛋白在制备用于抑制肿瘤细胞侵袭、转移的药物中的应用。本发明采用如下技术方案：EphrinA1蛋白在制备用于抑制肿瘤细胞侵袭和或转移的药物中的应用。所述药物靶向EphrinA1蛋白，抑制、敲低或敲除EphrinA1的表达。进一步地，所述药物至少包含以下有效成分中的一种：靶向EphrinA1的纳米药物，靶向EphrinA1的CRISPR基因编辑质粒，靶向EphrinA1的siRNA，靶向EphrinA1的shRNA，靶向EphrinA1的LNA，靶向EphrinA1的化学修饰的ASO，阻断EphrinA1功能的小分子抑制剂，EphrinA1的多克隆抗体，EphrinA1的单克隆抗体，EphrinA1的人源化抗体，EphrinA1的纳米抗体，双特异性抗体，靶向EphrinA1的抗体药物。进一步地，单克隆抗体包括兔源，鼠源，狗源，猴源，驼源，鸡源，鲨源等，多克隆抗体包括鸡源，兔源，羊源，驼源等。进一步地，通过以下手段敲低、敲除EphrinA1蛋白：siRNA、shRNA、基因编辑；其中基因编辑技术包括DNA同源重组，TALEN-TALEA靶向基因敲除技术，CreLoxp系统，FLP-frt系统，四环素干扰素等诱导性CreLoxp系统，CRISPRCas9基因编辑技术。进一步地，肿瘤包括鼻腔及鼻窦恶性肿瘤，鼻咽癌，口腔癌，喉癌，涎腺肿瘤，颅内肿瘤，甲状腺癌，舌癌，肺癌，食管癌，贲门癌，乳腺癌，纵膈肿瘤，胃癌，大肠癌，直肠癌，肝癌，胰腺癌与壶腹周围癌，小肠恶性肿瘤，肾癌，前列腺癌，膀胱癌，子宫颈癌，卵巢癌，皮肤恶性黑色素瘤，淋巴瘤等。本发明的有益效果在于：通过一系列体内、体外功能实验发现，EphrinA1在胃癌的发生发展和转移中发挥重要的作用。在胃癌中EphrinA1的高表达与病人的不良预后和转移显著相关，提示EphrinA1具有成为胃癌患者生存预后指标的潜能。而通过抑制EphrinA1在癌细胞中的表达水平，能显著抑制胃癌细胞的侵袭能力和体内的转移能力。通过抗体阻断功能实验表明，EphrinA1的抗体能够有效的抑制胃癌细胞的侵袭能力。本发明显示EphrinA1可作为临床上抑制肿瘤转移的一个新的药物靶标。附图说明图1为EphrinA1结构示意图；图2.1为EphrinA1在胃癌组织中显著高表达图；图2.2为EphrinA1在不同胃癌细胞系中的表达水平；图2.3为EphrinA1蛋白水平高表达与胃癌转移显著相关；图2.4为EphrinA1蛋白高表达与胃癌病人的不良预后显著相关；图3.1为Westernblot检测EphrinA1的敲低效率；图3.2为MTT和粘附实验检测EphrinA1对细胞增殖和粘附的影响；n.s.，没有意义；图3.3为敲低EphrinA1对胃癌细胞的迁移和侵袭能力的影响；***，P0.001；图4.1为Westernblot检测EphrinA1的稳定敲低效率；图4.2为稳定敲低EphrinA1对胃癌细胞的侵袭能力的影响；；**，P0.01；*，P0.05；图5.1为Westernblot检测EphrinA1的过量表达效果；图5.2为过量表达EphrinA1对细胞增殖和粘附能力的影响；图5.3为过量表达EphrinA1对胃癌细胞的细胞迁移和侵袭能力的影响，***，P0.001；**，P0.01；图6.1为利用CRISPRCas9基因编辑构建EphrinA1敲除的细胞株；图6.2为EphrinA1敲除对胃癌细胞的细胞增殖和粘附能力的影响；图6.3为EphrinA1敲除对胃癌细胞的迁移和侵袭能力的影响；***，P0.001；图6.4为EphrinA1敲除对胃癌细胞的肺转移能力的影响；***，P0.001n＝5；图6.5为小鼠的肺部HE染色检测EphrinA1敲除对胃癌细胞肺转移能力的影响；***，P0.001n＝5；图6.6为EphrinA1敲除的胃癌细胞对小鼠体重的影响；图6.7为EphrinA1敲除对胃癌细胞在小鼠体内成瘤能力的影响；图7.1为Westernblot实验检测单克隆抗体对EphrinA1蛋白的识别；图7.2为胃癌细胞加入EphrinA1抗体后对细胞跨内皮迁移能力的影响。图8.1为GEPIA数据库中EphrinA1在不同癌症中的表达情况；图8.2为GEPIA数据库中EphrinA1在不同癌症中的表达与预后的相关性。具体实施方式根据在NCBI数据库记载的EphrinA1的序列信息，可以确定EphrinA1是一个定位在1号染色体，长1590bp,205aa的基因。如图1所示。本申请通过靶向敲低EphrinA1，发现对胃癌细胞的细胞增殖，细胞周期，克隆形成和细胞粘附没有明显影响，但是能显著的抑制胃癌细胞的体外侵袭和体内转移。利用CRISPRCas9技术靶向EphrinA1基因，显示EphrinA1缺失后，细胞的侵袭和转移能力受到显著的抑制。用抗体阻断EphrinA1的功能，能显著抑制胃癌细胞的侵袭能力。下面结合实施例对本发明作进一步地说明。实施例1，EphrinA1在人的胃癌组织和胃癌细胞系中显著高表达1.人的多种组织和人胃癌细胞系中EphrinA1的表达情况1.1组织在极低温度下利用研钵研磨成粉末状，粉末状的组织的总RNA的分离提取利用TRIZOL试剂购自美国Invitrogen，并按照试剂说明书的标准操作进行。1.2取一个PCR管A加入800ng总的RNA，补足DEPC水至总体积10μL，混匀。取另一个PCR管B加入10xRTbuffer2μL，10xrandomprimer2μL，dNTP0.8μL，RNA反转录酶1μL，DEPC水4.2μL，混匀。将B管的混合物加入管A中，混匀，利用PCR仪进行反转录反应购自美国ABI。程序如下：25℃10min37℃120min85℃5min将cDNA产物放置-20℃，备用。2.实时荧光定量PCRqRT-PCR检测EphrinA1在胃癌组织及其配对的正常组织中的表达情况使用BioRad公司CFX-TouchSystem荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR反应。所有的反应都重复三次。根据仪器给出的荧光图得到ΔCt值，从而计算相应表达水平的相对变化。引物如下：3.组织芯片检测EphrinA1蛋白水平的表达通过胃癌组织芯片检测EphrinA1在蛋白水平的表达情况，结果EphrinA1的蛋白在胃癌病人中高表达，Kaplan-Meier生存曲线分析具有5年生存信息的胃癌患者队列，结果EphrinA1的相对高表达与胃癌病人的不良预后显著相关。实验结果通过实时荧光定量PCR反应qRT-PCR对109对胃癌组织与其配对的正常组织进行EphrinA1表达的分析，EphrinA1在72.5％的胃癌肿瘤组织中相对上调表达图2.1左。此外，在11对年龄、性别配对的M0和M1期病人样本中，EphrinA1在具有转移的M1样本中显著高表达图2.1右。另外，还通过qRT-PCR检测了人不同胃癌细胞系中EphrinA1的表达情况，为后续功能实验提供参考图2.2。这些结果提示，EphrinA1可能在胃癌的转移过程中发挥重要的作用。通过胃癌组织芯片检测EphrinA1在蛋白水平的表达情况，结果EphrinA1的蛋白在胃癌病人中高表达图2.3，Kaplan-Meier生存曲线分析具有5年生存信息的胃癌患者队列，结果EphrinA1的相对高表达与胃癌病人的不良预后显著相关图2.4。实施例2，RNA干扰技术敲低EphrinA1的表达能显著的抑制胃癌细胞的侵袭1.细胞转染siRNA通过siRNA设计软件，设计并合成两条特异靶向EphrinA1，沉默其表达的siRNA购自中国上海吉玛。取对数生长期的细胞铺平板，待细胞密度达到50％左右，按照下表转染体系，分别用OPTI培养基购自美国Gibco稀释LipoRNAiMAX购自美国Invitrogen和siRNA，将稀释的siRNA加入LipoRNAiMAX管中，混匀后静置5min，然后加至细胞培养液中，摇匀，24后更换培养基。Component24-well6-wellSiRNA-lipidcomplexperwell50ul250ulFinalsiRNAusedperwell5pmol25pmolFinalLipoRNAiMAXusedperwell1.5ul7.5ul2.细胞增殖MTT实验转染后的细胞用10％FBS购自以色列BI的1640培养基购自美国Gibco进行重悬，用血球计数板计数。对于MTT实验，在96孔板中每孔加入1000个细胞100ul培养基，每组五个复孔，共需铺4块板用于检测细胞在不同时间点的增殖情况0h，24h，48h，72h。在每个时间点，每孔加5mgmlMTT购自美国Sigma在37℃培养箱孵育4h，用枪头小心吸取孔中溶液注意不要碰到孔的底部，加入150ulDMSO购自中国国药，混匀。在M5酶标仪上检测各时间点的OD490OD570的吸收光值并分析。3.细胞粘附实验3.1取96-well板进行预处理。Matrigel购自美国BD包被的细胞板，用预冷的无FBS的1640购自美国Gibco对matrigel进行1:40的稀释，每孔加入50μL进行包被；Fibronectin购自美国BD包被的细胞板，用预冷的无FBS的1640稀释fibronectin至0.02μgμL，每孔加入50μL进行包被。将matrigel和fibronectin包被的96-well板放入37℃细胞培养箱中孵育24h。3.2吸去未凝固的matrigel和fibronectin，每孔加入100μL，0.5％BSA购自中国上海生工PBS溶，37℃封闭30min。3.3弃去BSA，PBS温和洗两遍，每孔加入100μL，2x104的1％FBS的1640培养基重悬的细胞，37℃培养箱培养30min。3.4弃去上清，PBS温和洗两遍，每孔加100μL，4％PFA固定30min，弃去PFA中国国药，PBS温和洗两遍。3.5每孔加100μL亚甲基蓝染色30min，弃去亚甲基蓝染色液，用PBS温和洗4-5次。3.6配制裂解液无水乙醇与0.1MHCl体积比1:1混合，每孔加入150μL裂解液，混匀。并在无细胞的孔中加入150μL裂解液作为空白对照。3.7在M5酶标仪上检测OD620的吸收光值并分析。4.细胞迁移和侵袭实验4.1细胞迁移实验：将转染后的细胞按照细胞传代的方式进行重悬1％FBS的1640培养基重悬细胞并用血球计数板进行细胞计数。在transwell的上层小室中每孔中加入200ul细胞悬液细胞数目：5×104，在下室中加入700ul的10％FBS的1640培养基，放入培养箱中。待细胞迁移适当时间后，取出transwell并用4％PFA固定10min。0.1％的结晶紫染色15min。PBS清洗掉多余的结晶紫，用棉签小心的擦去transwell小室上层膜的细胞，在显微镜下观察侵袭到transwell下层膜上的细胞并进行拍照和统计分析。4.2细胞侵袭实验：在8μm的Transwell24-well，购自美国Corning中预先铺上10倍稀释的基质胶购自美国BD或0.5％的明胶购自中国上海生工50ul，37℃细胞培养箱孵育2h。然后将转染后的细胞重悬后，后续的操作步骤与迁移实验相同。实验结果前面的结果提示，EphrinA1在胃癌组织中显著高表达，并且其高表达与差的预后相关。那么，EphrinA1在胃癌的进程中，特别是胃癌的转移过程中是如何发挥作用的？因此我们设计了两个特异靶向EphrinA1，沉默EphrinA1表达的siRNA。在胃癌细胞系BGC823中转染siRNA敲低EphrinA1的表达，并通过Westernblot检测EphrinA1的敲低效率，结果显示与对照组的siRNA相比较，特异性靶向EphrinA1的siRNA下调EphrinA1的水平至对照组的30％左右图3.1，si-nc表示对照siRNA，si-1和si-2表示两条靶向EphrinA1的siRNA。在胃癌细胞系BGC823上检测敲低EphrinA1对胃癌细胞系的影响。由于肿瘤细胞的两个重要特征是能够无限增殖和容易转移。我们通过MTT实验和粘附实验检测EphrinA1对胃癌细胞的细胞增殖能力和对基质的粘附能力的影响，结果显示，EphrinA1的敲低对胃癌细胞的细胞增殖和基质粘附能力没有明显影响图3.2。通过细胞迁移和侵袭实验检测EphrinA1对肿瘤转移方面的影响。结果EphrinA1的敲低能够显著的抑制胃癌细胞的细胞迁移和侵袭能力图3.3。结果提示，EphrinA1可能通过影响胃癌细胞的侵袭能力影响胃癌的发生与发展。实施例3，稳定敲低EphrinA1能显著的抑制胃癌细胞的侵袭能力1.慢病毒载体构建1.1设计合成shEphrinA1根据shRNA设计原则，以EphrinA1RNA为靶序列，设计了两条针对EphrinA1的靶位点序列，合成相对应的正反向序列购自中国上海生工，分别为：1.2退火：各取100pM单链DNA,加入10x退火buffer，加ddH2O50uL。放入刚刚煮沸过的水中，使其慢慢冷却至室温。经过酶切，链接，鉴定，测序等步骤构建EphrinA1的shRNA慢病毒表达载体。2.慢病毒包装2.1将HEK293T细胞铺入T25瓶中，待细胞密度达到80-90％时，进行转染。2.2按照下列体系配制质粒混合成分体积ul慢病毒载体质粒1μgμL2.2包装质粒pVSVG1μgμL1.1包装质粒△8.911μgμL1.65P300010OPTI2502.3取15μLLippo3000混入250ulOPTI中具体转染方法详见lipo3000质粒转染步骤。2.4收集48h，72h的细胞培液，过滤分装后，浓缩，测滴度，-80℃冰箱中保存。3.筛选EphrinA1敲低的稳定细胞系取对数生长期的细胞铺平板，待细胞密度达到80％左右，弃去培养基，PBS清洗两遍，加入新鲜的10％FBS的1640培养基。在培养皿中逐滴加入适量的病毒原液，并加入5ugmL的Polybrene促进病毒的感染效率，混匀，37℃培养箱培养24小时后换液。慢病毒载体带有puromycin抗性标签，通过向细胞施加puromycin药物，筛选慢病毒表达的细胞。感染48h后，加入适量的puromycin药物，持续约两周。不施加药物培养一段时间，收取适量细胞，qRT-PCR检测EphrinA1的敲低效果，若与对照组的慢病毒载体相比，EphrinA1敲低组的EphrinA1表达水平显著下调，显示筛选得到EphrinA1敲低的稳定细胞系。实验结果EphrinA1能显著的促进胃癌细胞的侵袭能力。前面的数据提示，EphrinA1可能在胃癌的转移中发挥重要的作用。我们构建了EphrinA1敲低的稳定细胞系，Westernblot实验表明细胞系构建成功图4.1，sh-nc表示对照shRNA，sh-1和sh-2表示两条靶向EphrinA1的shRNA。EphrinA1稳定敲低能显著的抑制胃癌细胞的体外侵袭能力图4.2，这与EphrinA1的临床表达水平，预后情况以及siRNA敲低的实验结果一致。实施例4，过量表达EphrinA1能显著的促进胃癌细胞的侵袭能力1.构建pcDNA3.1-EphrinA1的质粒根据NCBI数据库获得EphrinA1的全长序列，设计全长的引物，通过PCR的方法获得EphrinA1的DNA产物，经过酶切，链接等步骤构建含有EphrinA1全长的pcDNA3.1过表达质粒。2.细胞转染质粒取对数生长期的细胞铺平板，待细胞密度达到80％左右，按照下表转染体系，分别用OPTI培养基稀释Lipo3000购自美国Invitrogen和质粒，将稀释的质粒加入Lipo3000管中，混匀后静置5min，然后加至细胞培养液中，摇匀，24后更换培养基。Component24-well6-wellPlasmid-lipidcomplexperwell50ul250ulFinalplasmidusedperwell500ng2500ngFinalP3000usedperwell1ul5ulFinalLipo3000usedperwell1.5ul7.5ul实验结果在EphrinA1含量相对丰富的BGC823细胞中敲低EphrinA1的表达能够显著的抑制胃癌细胞的侵袭能力。那么，过量表达EphrinA1对胃癌细胞又会有如何的影响？我们挑选了一株EphrinA1表达相对较少的细胞AGS，检测在人胃癌细胞系AGS细胞中过量表达EphrinA1对胃癌细胞的生物学功能的影响。Westernblot检测EphrinA1的过表达效率，与作为对照的空载质粒相比，EphrinA1过量表达的效果是其表达的5-10倍图5.1。研究结果显示，在AGS细胞中过量表达EphrinA1，对胃癌细胞的细胞增殖和细胞粘附图5.2没有明显影响，但是能显著的促进胃癌细胞的迁移和侵袭能力图5.3。这些数据与EphrinA1siRNA敲低的数据结果是一致的，显示EphrinA1调控胃癌细胞的侵袭。实施例5，利用CRISPRCas9基因编辑技术敲除EphrinA1能显著的抑制胃癌细胞的侵袭和体内转移能力1.靶向EphrinA1的CRISPRCas9基因编辑CRISPRCas9基因编辑技术靶向蛋白编码基因，可通过改变编码基因的几个碱基引起移码突变等效应，敲除编码的蛋白的表达。设计并合成两个特异性靶向EphrinA1的sgRNA，构建CRISPRCas9-EphrinA1sgRNA的载体。序列如下：EphrinA1sgRNA1EphrinA1-1-sense：5’-ACCGCTGATCGCCACACCGTCTTC-3’EphrinA1-1-antisense：5’-AACGAAGACGGTGTGGCGATCAGC-3’EphrinA1sgRNA2EphrinA1-2-sense：5’-ACCGACGGTGTGGCGATCAGCAG-3’EphrinA1-2-antisense：5’-AACCTGCTGATCGCCACACCGTC-3’按照质粒转染的方法，把EphrinA1sgRNA的CRISPRCas9载体转染人胃癌细胞系，通过单克隆筛选，并且利用基因组PCR及测序、cDNA的PCR及测序等方法验证鉴定出敲除EphrinA1的细胞株。另一方面，为避免CRISPRCas9产生的脱靶效应，我们除了设计序列特异的sgRNA，同时根据sgRNA预测的潜在脱靶位点，进行PCR及测序验证，保证没有出现脱靶。2.小鼠肺体内转移实验将1X106的野生型胃癌细胞和筛选出的EphrinA1基因敲除的胃癌细胞，通过尾静脉注射到小鼠的体内，每周观察小鼠的状态及体重变化，4-5周后，取肺观察肿瘤细胞的肺转移情况。3.小鼠皮下成瘤实验将5X106的野生型胃癌细胞和筛选出的EphrinA1基因敲除的胃癌细胞，与matrigel按1:1混合后，打入小鼠的皮下，观察肿瘤的生长情况，10-15天后，将皮下瘤块取出，称重，观察组间的变化。实验结果为了进一步探索EphrinA1在胃癌中发挥的生物学功能，我们利用CRISPRCas9基因编辑技术设计两个靶向EphrinA1的特异的sgRNA，通过单克隆筛选，测序鉴定以及脱靶效应鉴定，成功建立敲除EphrinA1敲除的胃癌细胞株图6.1,WT代表野生型的胃癌细胞株，ko1和ko2为筛选到的两株EphrinA1敲除的细胞株。检测EphrinA1敲除的胃癌细胞株的细胞生物学功能发现，与正常的野生型胃癌细胞相比较，EphrinA1敲除对胃癌细胞的增殖和细胞粘附图6.2没有明显影响。但是EphrinA1敲除的胃癌细胞株的迁移和侵袭能力明显受到抑制图6.3。这些数据显示EphrinA1敲除的细胞生物学功能与EphrinA1敲低引起的细胞生物学功能的变化是高度一致的。同时，也说明我们利CRISPRCas9技术建立的细胞株是成功敲除EphrinA1的细胞株。我们把构建的EphrinA1敲除的胃癌细胞株通过尾静脉注射建立小鼠的肺转移模型，研究EphrinA1对胃癌细胞转移的影响。小鼠接种胃癌细胞4周后，评估小鼠的肺转移情况。通过解剖取肺观察显示，对照组野生型的胃癌细胞发展严重肺转移，肺的体积显著增大，肺的重量也明显增重，肺部含有大量的肿瘤细胞，形成实质的瘤块，几乎观察不到完整的肺泡结构，而EphrinA1敲除的小鼠肺部转移灶显著减少，体积大小较正常，肺中也没有明显增加，具有相对完整的肺部结构图6.4。进一步的肺部HE染色也显示，对照组的肺部产生许多大的转移灶，但是EphrinA1敲除组的肺部只观察到少许的微转移灶图6.5。同时，我们每周观察小鼠的生长状态，并测量小鼠的体重,显示与EphrinA1敲除组的小鼠相比，对照组的小鼠由于产生严重的肺转移，进而危害小鼠的健康状态，使小鼠在转移的后期体重明显下降图6.6。研究显示，EphrinA1敲除的胃癌细胞能显著降低胃癌的肺转移能力。我们把胃癌细胞与matrigel按1:1混合后，打入小鼠的皮下，构建体内成瘤的动物模型。10-15天后观察肿瘤的生长情况，结果显示，对照组野生型的胃癌细胞长成很大的瘤块，而EphrinA1基因敲除的胃癌细胞肿瘤大小明显减小，甚至不能成瘤图6.7。这一结果说明虽然在体外并不影响胃癌细胞的生长，但在体内复杂的肿瘤微环境的作用下EphrinA1敲除能显著抑制胃癌细胞在体内的生长能力。实施例6，利用EphrinA1抗体阻断EphrinA1的功能进而抑制胃癌转移1.EphrinA1抗原表达质粒构建根据NCBI数据库中的EphrinA1基因序列，设计全长引物通过PCR手段扩增EphrinA1基因全长，经过酶切，连接，转化，质粒抽提等步骤，将EphrinA1全长序列构建到pET-28a载体中，得到pET-28a-EphrinA1全长表达质粒。引物如下：Primer-F：GTCAAAGCTTGCGAGTTCCTCTGGGCCCCTCTCTTPrimer-R：GTCACTCGAGTCACGGGGTTTGCAGCAGCAGAA2.蛋白表达纯化2.1转化质粒：取重组质粒0.5μL，转化到100μLROSETTA感受态中，涂板培养12-16h。2.2小量诱导：挑取两个单菌落，分别接种于5mLLB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度1mmoll，37℃继续培养4h。12000rpm离心10min，弃上清，菌体用裂解液裂解后，加入20-30μl5×LoadingBuffer沸水煮沸10min，取10ul样品用于SDS-PAGE分析。2.3大量诱导：接种3ml菌液至300ml含相应抗生素的LB培养基中，诱导方法同2.2。2.4超声破菌：5000rpm离心10min分别收集诱导表达后的300ml菌液中的菌体，菌体用10ml的0.01MPBSpH7.4溶液重悬；冰水浴下100W超声16min；4℃，5000rpm离心10min分别收集沉淀和上清，上清留样20ul进行SDS-PAGE电泳检测；用10ml的无咪唑的8M尿素溶液重悬分散沉淀；冰水浴下100W超声10min，留样20ul进行电泳检测；4℃，5000rpm离心15min收集上清。2.5样品的选择：经过检测蛋白表达在包涵体中，将蛋白进行His标签蛋白的纯化。2.6蛋白透析及浓缩定量：通过透析提高蛋白的纯度和浓度，最后将浓缩后的蛋白样品取出，进行电泳检测和蛋白浓度测定。3.多克隆抗体制备3.1动物免疫：取两只新西兰白兔，抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子上采用多点注射法进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用14的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。3.2取血：免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体。最后一次取血可以采用颈动脉放血，一般一只家兔可放血100-120ml。3.3血清的分离：如果用离心管收集，37℃烘箱放置2h，转移到4℃沉淀过夜，第二天早上离心，10000rcf，10分钟。在血清中加入NaN3至终浓度0.02％，分装后-20℃保存。3.4通过抗原亲和纯化方式纯化抗体并检测抗体效价。4.单克隆抗体制备4.1动物免疫：按照常规方案，用靶蛋白EphrinA1蛋白免疫5只Balbc小鼠，共免疫3-4次，每次免疫7天后，用间接ELISA方法检测免疫动物血清，以此确定免疫应答的水平。4.2细胞融合和筛选：取小鼠脾脏，将脾细胞和骨髓瘤细胞采用电融合方法进行2轮细胞融合。用间接ELISA方法筛选融合细胞的上清液，挑选出对靶蛋白Ephrin-A1呈阳性的上清。将阳性母克隆细胞转到24孔板扩大培养。每个扩大培养的克隆收集2ml上清，用于间接ELISA检测和FACS检测。冻存所有特异性阳性克隆细胞，以避免克隆丢失。4.3亚克隆，扩大培养和低温保存：采用有限稀释法对阳性母克隆进行亚克隆，以确保这些阳性母克隆分别来自于单个母克隆细胞。进行3轮亚克隆，一般亚克隆的成功率在80％。用间接ELISA方法进行亚克隆筛选。每个母克隆选择2个稳定的子克隆进行扩增和低温保存。4.4抗体生产：对单克隆细胞进行抗体生产，每株细胞获得1～5mg抗体量。采用抗原亲和纯化方法纯化抗体，用透析方法将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液PBS中。5.EphrinA1抗体功能阻断实验利用制备好的EphrinA1抗体，施加到正常培养的胃癌细胞系中，使抗体与EphrinA1抗原结合，阻止细胞膜表面的EphrinA1发挥功能，检测对细胞侵袭转移能力的影响。实验结果我们通过抗体制备手段制备了EphrinA1的多克隆和单克隆抗体，通过ELISA检测证实多克隆抗体的效价较高表1，单克隆抗体在小鼠免疫后血清效价检测表2、杂交瘤细胞制备腹水效价检测表3、纯化的单克隆抗体效价检测表5，结果均合格。通过腹水和细胞上清检测单抗亚型为IgG1，轻链为k链表4。Westernblot实验也证实抗体能够识别EphrinA1蛋白图7.1。将制备好的EphrinA1抗体，施加到胃癌细胞中，能抑制胃癌细胞的侵袭能力和跨内皮细胞迁移能力图7.2，1A7和2D7分别表示两株筛选到的杂交瘤细胞名称，及由这两株细胞制备产生的腹水和最终纯化得到的抗体名称。结果说明EphrinA1抗体能有效识别并结合EphrinA1蛋白，阻断EphrinA1的功能，进而抑制胃癌细胞的侵袭和转移能力，可能成为治疗胃癌的重要手段。表1纯化的多克隆抗体效价检测表2小鼠最后一次免疫后血清效价检测表3小鼠腹水效价检测：两个单抗的腹水效价合格表4小鼠腹水亚型检测：单抗亚型为IgG1，轻链为k链表5纯化的单克隆抗体效价检测实施例7，EphrinA1在多种肿瘤中表达异常并且与病人的不良预后相关前面我们的研究发现EphrinA1在胃癌中异常高表达并且导致病人出现差的预后，EphrinA1的高表达能显著促进胃癌细胞的侵袭和转移能力。为了进一步证明EphrinA1作为抗肿瘤靶点的广泛性和有效性，我们在其他癌症中分析了EphrinA1的表达和预后情况。GEPIA网站包含TCGAandGTEx数据库的数据，包括肿瘤正常组织的差异表达分析、不同癌症类型或病理阶段的分析、生存分析、相关性分析和降维分析等多种分析模块网址：http:gepia.cancer-pku.cn。我们在GEPIA网站分析了EphrinA1在不同癌症中的表达情况以及与病人预后的相关性。实验结果：在GEPIA网站分析EphrinA1的表达情况发现，EphrinA1在宫颈鳞状细胞癌CESC、胆癌CHOL、食管癌ESCA、结肠癌COAD、肝癌LIHC、卵巢癌OV、脑低分化胶质瘤LGG、子宫内膜癌UCEC等癌症中显著高表达图8.1，纵坐标为log2TPM+1的值。分析EphrinA1的表达与病人预后的相关性，发现在宫颈鳞状细胞癌CESC、食管癌ESCA、卵巢癌OV、脑低分化胶质瘤LGG等癌症中高表达会导致病人预后不良图8.2。结果说明EphrinA1在多种肿瘤中异常表达，并且与病人的预后情况密切相关，可以作为肿瘤预后的标志物和抗肿瘤药物靶点。

权利要求：1.EphrinA1蛋白在制备用于抑制肿瘤细胞侵袭和或转移的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物靶向EphrinA1蛋白，抑制、敲低或敲除EphrinA1的表达。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物至少包含以下有效成分中的一种：靶向EphrinA1的纳米药物，靶向EphrinA1的CRISPR基因编辑质粒，靶向EphrinA1的siRNA，靶向EphrinA1的shRNA，靶向EphrinA1的LNA，靶向EphrinA1的化学修饰的ASO，阻断EphrinA1功能的小分子抑制剂，EphrinA1的多克隆抗体，EphrinA1的单克隆抗体，EphrinA1的人源化抗体，EphrinA1的纳米抗体，双特异性抗体，靶向EphrinA1的抗体药物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，单克隆抗体包括兔源，鼠源，狗源，猴源，驼源，鸡源，鲨源等，多克隆抗体包括鸡源，兔源，羊源，驼源等。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过以下手段敲低、敲除EphrinA1蛋白：siRNA、shRNA、基因编辑；其中基因编辑技术包括DNA同源重组，TALEN-TALEA靶向基因敲除技术，CreLoxp系统，FLP-frt系统，四环素干扰素等诱导性CreLoxp系统，CRISPRCas9基因编辑技术。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，肿瘤包括鼻腔及鼻窦恶性肿瘤，鼻咽癌，口腔癌，喉癌，涎腺肿瘤，颅内肿瘤，甲状腺癌，舌癌，肺癌，食管癌，贲门癌，乳腺癌，纵膈肿瘤，胃癌，大肠癌，直肠癌，肝癌，胰腺癌与壶腹周围癌，小肠恶性肿瘤，肾癌，前列腺癌，膀胱癌，子宫颈癌，卵巢癌，皮肤恶性黑色素瘤，淋巴瘤等。

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