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申请/专利权人：山西农业大学

摘要：本发明公开了一种基于台蘑香蕈子实体干品的菌种分离纯化和鉴定方法，是通过先将台蘑香蕈干子实体的菌褶组织用焦磷酸钠漂洗清洁配成孢子悬液，并加至抑菌用Be培养基在25±1℃下培养72h，于40倍物镜下镜检挑选萌发的无色透明单核菌丝，将其转移至新的Be抑菌培养基中；将长有5~6个萌发孢子的小菌落分散接种到具有PDA培养基的培养皿中继续培养得到台蘑香蕈纯菌丝体；然后提取台蘑香蕈DNA并建立SCAR扩增体系，并进行香蕈SCAR扩增产物的检测。本发明有效解决了现有台蘑香蕈子实体干品的纯菌种和驯化中存在台蘑与其相似种类形态差异小，不易肉眼区分，难以获得相应纯菌种问题，具有操作性强，纯化和鉴定方法简单的特点。

主权项：1.一种基于台蘑香蕈子实体干品的菌种分离纯化和鉴定方法，其特征在于：是通过如下步骤实现的：（1）制作抑菌培养基：将1-正丁胺基甲酰-2-苯并咪唑-氨基甲酸甲酯溶于无菌水中，得到苯菌灵溶液，然后向经55~65℃预热融化的PDA培养基中加入苯菌灵溶液，再在无菌条件下倒平板制成抑菌用Be培养基；（2）配制梯度孢子悬液：先将台蘑香蕈干子实体的菌褶组织用0.1molL的焦磷酸钠溶液漂洗8~12s后，用将焦磷酸钠溶液吸出，然后用无菌水浸洗8~12s后将无菌水吸出，再用无菌水将洗净后的台蘑香蕈干子实体的菌褶组织配制成一组不同浓度的孢子悬液；（3）孢子萌发和转接：将步骤（2）配制的孢子悬液加至步骤（1）制作的抑菌用Be培养基中，在25±1℃下培养24h，置于40倍物镜下镜检挑选萌发的无色透明单核菌丝，将其转移至新的Be抑菌培养基中；4培养杂合菌株：将长有5~6个萌发孢子的小菌落分散接种到具有PDA培养基的培养皿中，在25±1℃下培养5~6d，挑取无拮抗作用的杂合菌丝观察具有锁状联合，基内菌丝形态为致密整齐，无色素等沉积物，气生菌丝的形态为纯白色，密集匍匐，粗绒状，初步确定为台蘑香蕈纯菌丝体；（5）制备菌丝干品：将步骤（4）中的台蘑香蕈纯菌丝体液氮冻干备用；（6）提取台蘑香蕈DNA：将冻干的台蘑香蕈纯菌丝体中加入氧化钴珠，在预冷至12~15℃的磨样机中，以骨骼-肌肉模式磨样500s后，采用Omega试剂盒进行DNA提取并将提取的台蘑香蕈DNA在4℃冰箱保存；7台蘑香蕈SCAR扩增体系建立：将提取的台蘑香蕈DNA用无菌水稀释得到体积分数为10%的模板DNA，采用台蘑引物ITS8F是5′-AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGT3′，引物LR3是3′-GGTCCGTGTTTCAAGGC-5′，扩增体系是由10×PCRbuffer5μL、含Mg2+的2.5mmolL的dNTP4μL、5UulTaqDNAPolymerase0.8μL、10μmolL检测引物ITS8F和LR3各1μL、模板DNA2μL、ddH2O36.2μL组成的；在94℃预变性1min后进行SCAR-PCR反应；SCAR-PCR反应条件为94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸5min；（8）台蘑香蕈SCAR扩增产物的检测：扩增结束后的SCAR-PCR反应产物在1%的琼脂糖凝胶上进行DNA电泳检测，电泳条件为100v，1h，在凝胶成像系统上检测并拍照扩增得到的DNA特异条带，测序并分析得到的分子量为1129bp的片段为台蘑香蕈菌种的标志物。

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百度查询： 山西农业大学 一种基于台蘑香蕈子实体干品的菌种分离纯化和鉴定方法