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申请/专利权人：扬州大学

摘要：本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测牛结核病的ELISpot检测试剂盒及其在牛结核病诊断领域的应用。所述检测试剂盒中包括支持介质、捕获抗体、检测抗体，所述捕获抗体可由保藏号为CCTCCNO：C2017283的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生，所述检测抗体为与所述捕获抗体不同的γ干扰素单克隆抗体。本发明试剂盒与牛结核病BOVIGAM®ELISA检测试剂盒、牛结核病抗体检测试剂相比，能够实现牛分枝杆菌感染的更灵敏、高特异性检测，排除了交叉反应带来的假阳性干扰，显示了良好的应用前景。

主权项：1.一种牛γ干扰素的ELISpot检测试剂盒，所述试剂盒包括：（1）选自以下任一：1）支持介质和捕获抗体；2）包被有捕获抗体的支持介质；所述捕获抗体为第一单克隆抗体，所述第一单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链包括氨基酸序列如SEQIDNO.1～3所示的CDR区，所述重链包括氨基酸序列如SEQIDNO.6～8所示的CDR区；（2）检测抗体；所述检测抗体为经过标记的第二单克隆抗体，所述第二单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链包括氨基酸序列如SEQIDNO.21～23所示的CDR区，所述重链包括氨基酸序列如SEQIDNO.26～28所示的CDR区。

全文数据：一种用于检测牛结核病的ELISpot检测试剂盒技术领域本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测牛结核病的ELISpot检测试剂盒及其在牛结核病诊断领域的应用。背景技术牛结核病是由牛分枝杆菌Mycobacteriumbovis引起的人兽共患慢性传染病，以组织器官的结核结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征，多侵害肺、乳房、肠和淋巴结等。严重威胁牛群的健康状况，对畜牧业生产和人类健康造成非常大的危害。结核分枝杆菌是一种兼性胞内寄生菌，感染机体后可引起细胞免疫应答，进而产生一系列细胞因子，在机体对抗感染的过程中发挥重要作用。在机体感染结核分枝杆菌时，特定的免疫原性蛋白可以激活T细胞反应，包括活化巨噬细胞和CD4+T细胞和CD8+毒性T细胞，产生几种重要的细胞因子，如γ干扰素IFN-γ、肿瘤坏死因子αTNF-α等。这些细胞因子在清除机体内结核分枝杆菌的过程中起着重要的作用。特别是IFN-γ的分泌是宿主产生T细胞免疫反应的重要指标，其在对抗结核分枝杆菌感染中发挥重要作用，通过检测抗原特异性的IFN-γ分泌状况可间接反映机体在结核分枝杆菌感染后的细胞免疫状况。IFN-γ主要是由特异性抗原刺激而活化的CD4+Th1细胞、CD8+T细胞及NK细胞等产生的细胞因子，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤活性以及免疫调节功能，是机体防御系统的重要组成部分。IFN-γ的免疫学检测是在特异性抗IFN-γ单克隆抗体MAb的基础上建立的用于对样本中的IFN-γ进行定性定量分析的实验方法。应用不同的单克隆抗体标记物和检测技术，已经开发出多种方法，如酶联免疫吸附试验ELISA，酶联免疫斑点法ELISpot，流式细胞术FCM分析法等。现阶段牛结核病的检测方法主要包括以下几种：1细菌学方法，通过培养病原体，根据其生物学特征进行判断，诊断的可靠性和准确性较高；但是牛分枝杆菌生长缓慢，分离率低20％左右，需要生物安全措施，同时对于病理部分样品的采集需要屠宰奶牛，不适用于活畜的检疫，严重影响了该方法的推广；2分子生物学技术，如建立的结核分枝杆菌属特异性的PCR检测方法，但实验条件要求较高，不便于普及；3免疫学检测方法包括血清学检测和细胞免疫检测，一般认为分枝杆菌引起的机体免疫应答以细胞免疫为主，而非体液免疫，因此检测抗体的ELISA方法应用价值受限。目前在我国牛结核病检疫过程中，主要采用牛型结核菌素以下简称PPD进行单纯颈部皮试变态反应，但该方法存在较多的假阳性。另外，该方法具有操作过程困难，试验所需时间较长、受外界干扰因素较多、结果判定主观性较强等一系列缺点。4γ-干扰素ELISA检测试验，γ-干扰素释放试验的基本原理同TST，但整个操作过程在体外进行。与TST相比，γ-干扰素ELISA检测试验不仅具有较高的敏感性和特异性，而且结果更加客观可靠，检测结果不受前者影响，同时只需与动物接触一次，对野生动物和难以保定的大型动物的检测具有巨大的优越性。同时，γ-干扰素释放试验模拟了结核分枝杆菌感染机体的免疫应答，在一定程度上反映了结核分枝杆菌感染早期宿主的免疫状态，所以此方法可用作结核病的早期感染检测，特别是结核分枝杆菌处于潜伏感染状态下机体没有明显的体液免疫应答和病理变化时，该方法更具优势。但γ-干扰素ELISA检测试验是群体水平检测，若群体细胞因子水平提高，ELISA不能区分是分泌细胞因子的细胞数量增加，还是单个分泌水平增加。这种区别对研究生物体的细胞免疫是很重要的，但是群体水平的检测不能区别出来，只有单细胞水平的检测能够胜任。但是，上述检测方法仍然不能满足本领域对牛分枝杆菌感染的特异性检测的现实需要。目前，牛结核菌素皮内变态反应试验是公认的特异性和敏感性相对较高的结核病诊断方法。由于结核菌素纯蛋白衍生物PPD成分复杂，包含的很多蛋白同时存在于致病分枝杆菌和环境非致病分枝杆菌中，不能区分结核阳性感染、免疫个体以及环境分枝杆菌感染等情况，从而使结核菌素皮内变态反应的特异性受到一定程度影响。因此，需要建立灵敏度更高，特异性更好的试剂盒用于牛结核病的检测。发明内容为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于检测牛结核病的ELISpot检测试剂盒及其在牛结核病诊断领域的应用，该试剂盒能够对牛结核病进行高度灵敏、特异的检测。为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链包括氨基酸序列如SEQIDNO.1～3所示的CDR区，所述重链包括氨基酸序列如SEQIDNO.6～8所示的CDR区。一种实施方式中，所述重链和轻链通过二硫键连接。一种实施方式中，所述单克隆抗体，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.4或其保守型变异序列，其重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.9或其保守型变异序列。一种实施方式中，所述轻链可变区的编码核苷酸序列为SEQIDNO.14或其保守型变异序列，所述重链可变区的编码核苷酸序列为SEQIDNO.19或其保守型变异序列。一种实施方式中，所述单克隆抗体是鼠源性的。一种实施方式中，所述单克隆抗体亚类为IgG2a。一种实施方式中，所述单克隆抗体为牛γ干扰素单克隆抗体。一种实施方式中，所述单克隆抗体，由保藏号为CCTCCNO：C2017283的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。保藏号为CCTCCNO：C2017283的杂交瘤细胞株已经于2017年12月7日在中国典型培养物保藏中心地址：武汉市武汉大学注册保藏，保藏号为CCTCCNO：C2017283，分类命名为杂交瘤细胞株3E9。本发明第二方面，提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链包括氨基酸序列如SEQIDNO.21～23所示的CDR区，所述重链包括氨基酸序列如SEQIDNO.26～28所示的CDR区。一种实施方式中，所述重链和轻链通过二硫键连接。一种实施方式中，所述单克隆抗体，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.24或其保守型变异序列，其重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.29或其保守型变异序列。一种实施方式中，所述单克隆抗体，所述轻链可变区的编码核苷酸序列为SEQIDNO.34或其保守型变异序列，所述重链可变区的编码核苷酸序列为SEQIDNO.39或其保守型变异序列。一种实施方式中，所述单克隆抗体是鼠源性的。一种实施方式中，所述单克隆抗体亚类为IgG1。一种实施方式中，所述单克隆抗体为牛γ干扰素单克隆抗体。一种实施方式中，所述单克隆抗体，由保藏号为CCTCCNO：C2017282的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。保藏号为CCTCCNO：C2017282的杂交瘤细胞株已于2017年12月7日在中国典型培养物保藏中心地址：武汉市武汉大学注册保藏，分类命名为：杂交瘤细胞株6F8。本发明的第三方面，提供前述第一方面的单克隆抗体和前述第二方面的单克隆抗体在制备牛疫病的检测试剂或诊断试剂中的用途。进一步地，提供前述第一方面的单克隆抗体和前述第二方面的单克隆抗体在制备牛γ干扰素的ELISpot检测试剂盒中的用途。本发明的第四方面，提供一种牛γ干扰素的ELISpot检测试剂盒，所述试剂盒包括：1选自以下任一：1支持介质和捕获抗体；2包被有捕获抗体的支持介质；所述捕获抗体为第一单克隆抗体；2检测抗体；所述第二抗体为经过标记的第二单克隆抗体；本发明所述试剂盒中，所述捕获抗体与所述检测抗体能与牛γ干扰素共同发生抗原抗体结合作用。所述经过标记的第二单克隆抗体中的第二单克隆抗体不同于前述捕获抗体。一种实施方式中，所述检测抗体为生物素标记或碱性磷酸酶标记的第二单克隆抗体。进一步地，所述检测抗体为生物素标记的第二单克隆抗体。生物素标记第二单克隆抗体的方法采用常规。一种实施方式中，所述捕获抗体，也就是第一单克隆抗体为本发明前述第一方面所述的单克隆抗体。一种实施方式中，所述检测抗体，也就是第二单克隆抗体为本发明前述第二方面所述的单克隆抗体。所述试剂盒中，所述支持介质可以事先包被有捕获抗体，也可以只提供空白支持介质与捕获抗体，在检测前由操作者自行采用常规方法在支持介质上包被捕获抗体。其中，所述支持介质与试剂接触面上可有微孔滤膜。因此，所述支持介质为微孔滤膜板。所述微孔滤膜板可为各种常见规格的微孔滤膜板，如96孔滤膜板。更优选地，所述支持介质为披覆PVDF薄膜微孔培养板。其中，优选地，所述支持介质与试剂接触面上有PVDF膜。进一步地，所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：1亲和素-碱性磷酸酶结合物；2底物显色液；3稀释液；4洗涤液；5封闭液；6阴性对照；7阳性对照；8特异性刺激剂；9非特异性刺激剂。上述试剂均为ELISopt检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的选择是试剂盒中同时包括亲和素-碱性磷酸酶结合物、底物显示液和洗涤液。所述底物液可为ELISpot检测试剂盒中常用的通用底物显示液，如液氮蓝四唑5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸NBTBCIP底物显示液。所述洗涤液可为ELISpot检测试剂盒中常用的洗涤液，如磷酸盐缓冲液等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。所述封闭液可为包被微孔滤膜板常用的封闭液，如脱脂乳液、FBS、BSA或酪蛋白等。进一步的，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他ELISpot检测所需通用试剂，如细胞培养液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液等。所述阴性对照的组分与进行检测的样本组的各组分相同，但不添加刺激剂。所述阳性对照的组分与进行检测的样本组的各组分相同，但用非特异性刺激剂替换特异性刺激剂。进一步地，非特异性刺激剂为PWM。特异性刺激剂为Mb3904-Mb3905CFP-10和ESAT-6，即CE蛋白。通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。本发明进一步基于上述BoIFN-γELISpot检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵敏度的牛γ干扰素的ELISpot检测方法，用于检测分泌牛γ干扰素的T淋巴细胞，从而进行机体免疫状态评价及疾病诊断方面的研究。利用本发明的试剂盒检测牛外周血单个核细胞样品的检测方法包括下列步骤：1捕获抗体包被支持介质例如微孔滤膜板；2制备牛外周血单个核细胞悬液；3细胞孵育及检测1.取上述捕获抗体包被的支持介质微孔滤膜板，分别将特异性刺激剂例如CE蛋白、阳性对照例如美洲商陆PWM、阴性对照例如完全1640培养基加入到各孔中；2.加入待检PBMC加入到各孔中，使反应板中的溶液混匀；3.盖上盖子，37℃孵育24-48h；4.用洗液洗涤每个板孔；5.洗板后，加入稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，37℃孵育；6.每孔中加入100μL底物显色液，贴上封板膜，37℃避光显色5-10min。7.使用水冲洗终止反应后，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3小时烘干；8.使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛γ干扰素的T细胞；或使用ELISPOT读板仪计数，对实验结果进行扫描计数和分析。本发明的第五方面，提供前述ELISpot检测试剂盒在非诊断目的牛结核分枝杆菌感染检测中的应用。其中，所述非诊断目的包括流行病学分析和研究、离体组织检测、表位鉴定研究以及定性和定量检验结核分枝杆菌抗原特异的牛IFN-γ。本发明的第六方面提供一种分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCCNO：C2017283。该杂交瘤细胞株已经于2017年12月7日在中国典型培养物保藏中心地址：武汉市武汉大学注册保藏，保藏号为CCTCCNO：C2017283，分类命名为杂交瘤细胞株3E9。本发明的第七方面提供前述分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备牛疫病的检测试剂或诊断试剂中的用途。进一步地，前述分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株可用于制备牛γ干扰素的ELISpot检测试剂盒。本发明的第八方面，提供一种分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNO：C2017282。保藏号为CCTCCNO：C2017282的杂交瘤细胞株已于2017年12月7日在中国典型培养物保藏中心地址：武汉市武汉大学注册保藏，分类命名为：杂交瘤细胞株6F8。本发明的第九方面，提供前述分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备牛疫病的检测试剂或诊断试剂中的用途。进一步地，前述分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株可用于制备牛γ干扰素的ELISpot检测试剂盒。本发明生物材料保藏信息如下：名称：杂交瘤细胞株3E9；保藏号为：CCTCCNO：C2017283；保藏日期：2017年12月7日；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位简称：CCTCC；保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。名称：杂交瘤细胞株6F8保藏号为：CCTCCNO：C2017282；保藏日期：2017年12月7日；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位简称：CCTCC；保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1本发明试剂盒中所采用的由杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势。2本发明试剂盒中所采用的牛分枝杆菌特异性抗原Mb3904、Mb3905由RD1基因编码，RD1只存在于结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌，而在BCG卡介苗中缺失，因此Mb3904和Mb3905作为刺激剂特异性更高。3本发明基于的试剂盒为基于细胞水平的检测，相比于皮试，排除了交叉反应造成的假阳性的干扰，显示出良好的特异性；4此外本发明基于的ELISpot试剂盒，相比于其他的基于抗体的商品化ELISA试剂盒，具有更高的灵敏度。5此外本发明基于的ELISpot试剂盒，与皮试和商品化ELISA试剂盒相比，具有较高的符合率。附图说明图1：牛结核病ELISpot检测试剂盒检测结果。图2：基于非特异性刺激原PWM的ELISpot检测试剂盒与牛γ干扰素ELISpot检测方法的比较结果，其中，A为空白对照组，B为阴性对照组，C为阳性对照组。图3：ELISpot试剂盒与Mabtech公司抗体对的比较结果。图4：牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒。图5：基于CE蛋白的ELISpot检测试剂盒与基于PPD的ELISpot检测方法结果，A、C为CE蛋白刺激组，B、D为PPDB刺激组。具体实施方式本发明的检测牛结核病ELISpot检测试剂盒能够特异性地检测牛结核病，其检测灵敏度高于ELISA水平。术语“ELISpot”是酶联免疫斑点实验的简称，它最大的优点是单细胞水平的检测，是活细胞功能的检测，比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌靶蛋白的细胞。传统的检测牛结核的ELISA方法都是群体水平的检测，但是如果群体细胞因子水平提高，既有可能是分泌细胞因子的细胞数量增加，也有可能是分泌细胞的数量没增加而单个分泌水平增加。这种区别对研究生物体的细胞免疫是很重要的，但是群体水平的检测不能区别出来，只有单细胞水平的检测能够胜任。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，ChromatinP.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocolsP.B.Becker，ed.HumanaPress，Totowa，1999等。实施例1杂交瘤细胞株的获取以及单克隆抗体的制备保藏号为CCTCCNO：C2017283的杂交瘤细胞株及保藏号为CCTCCNO：C2017282的杂交瘤细胞株的获得。1.动物免疫具体免疫程序如下：首次免疫，腹部皮下多点注射100μg经弗氏完全佐剂充分乳化的重组牛γ干扰素纯化蛋白，2周后腹部皮下多点注射100μg经弗氏不完全佐剂充分乳化的纯化蛋白进行二次免疫，间隔两周后腹腔注射100μg不加佐剂的纯化蛋白进行第三次免疫，7d后眼眶采血测定血清抗体效价，选取效价较高的小鼠进行尾静脉加强免疫100μg不加佐剂的纯化蛋白。2.细胞融合具体步骤如下：尾静脉加强免疫3d后，采集少量血液，分离血清-20℃冻存，作为筛选时的阳性对照。按生物安全方法处死免疫鼠，75％酒精浸泡5min，无菌取脾脏细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP20在PEG作用下融合，用ICR小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融合好的细胞及饲养细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃、6％二氧化碳培养箱中培养。5d后加入新鲜HAT培养基，10d后改用HT培养基进行培养，定期观察，换液和检测。3.间接ELISA检测方法的建立采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆。方阵试验确定检测抗原的包被浓度。检测抗原包被缓冲液横向梯度稀释，每孔50μL包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，4℃过夜；免疫鼠血清纵向倍比稀释，每孔50μL，正常小鼠血清同样倍数稀释作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗第三次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔50μL，37℃孵育1.5h，PBST洗涤后，OPD显色，酶联检测仪测定OD490的值，判定检测抗原的最佳包被浓度。4.筛选阳性克隆采用建好的间接ELISA方法检测杂交瘤细胞分泌的抗体情况。具体方法如下：将杂交瘤细胞培养上清加入预先包被好的ELISA板中，50μL孔，以SP20细胞上清作为阴性对照，免疫多抗血清作为阳性对照，37℃水浴2h；PBST洗涤3次；加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG和IgM抗体，50μL孔，37℃水浴1.5h；洗涤后，OPD显色10～15min，显示终止后酶标仪测定OD490读数。被测孔OD490读数大于阴性对照两倍以上判定为阳性。将筛选到的两株阳性克隆分别命名为阳性细胞克隆3E9和阳性细胞克隆6F8。5.阳性杂交瘤细胞的克隆化采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆3E9和6F8进行2～3次的亚克隆并进行保藏。阳性细胞克隆3E9对应保藏号为CCTCCNO：C2017283的杂交瘤细胞株，阳性细胞克隆6F8保藏号为CCTCCNO：C2017282的杂交瘤细胞株。6.腹水的制备采用体内诱生腹水法，按常规方法进行。10～12周龄健康的BALBc小鼠腹腔注射液体石蜡0.3～0.5ml只，7～10d后，分别腹腔接种经PBS稀释的培养至对数生长期的杂交瘤细胞3E9和6F8，5×105个细胞只；7d后收集腹水，离心去除沉淀，收集上清，间接ELISA测定抗体效价，分装，-70℃保存。保藏号为CCTCCNO：C2017283的杂交瘤细胞株或其传代细胞株对应杂交瘤细胞3E9分泌产生的单克隆抗体记作单克隆抗体3E9，保藏号为CCTCCNO：C2017282杂交瘤细胞株或其传代细胞株对应杂交瘤细胞6F8分泌产生的单克隆抗体记作单克隆抗体6F8。7.抗体的纯化标记将制备的3E9和6F8腹水使用ProteinG亲和层析方法进行纯化，并将单克隆抗体6F8进行生物素标记。将纯化的单克隆抗体6F8采用标准生物素标记法进行标记，获得生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体Bio-6F8。溶解2～10mg单克隆抗体6F8蛋白于1mL的磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数；平衡生物素至室温，加2mgSulfo-NHS-Biotin于100μL超纯水中，加入一定浓度的生物素；室温30分钟，或冰上放置2小时；用30mLPBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5mL或1mL于单独的管中，以280nm的吸收值测定单克隆抗体蛋白含量。本发明的单克隆抗体6F8也可以使用本领域公知的其他方法进行标记。8.单克隆抗体特性检测①单克隆抗体亚类的鉴定按单克隆抗体亚类试剂盒说明书进行，采用抗原介导的ELISA法。在已包被抗原的酶标板内分别加入细胞培养上清50μL孔，37℃1h，PBST洗涤3次，每次5min分别加入1：1000稀释的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM亚类抗体50μL孔，37℃0.5h，每株单克隆抗体加每种亚类两孔，PBST洗涤3次每次5min；加入1：5000稀释的兔抗羊酶标二抗50μL孔，37℃15min，PBST洗涤3次；加显色液邻苯二胺OPD溶液50μL孔，37℃避光显色10～15min，2MH2SO450μL孔终止反应，以肉眼观察颜色明显高于其他孔者所加亚类抗体为单克隆抗体亚类。结果显示，单克隆抗体3E9亚类为IgG2a，单克隆抗体6F8亚类为IgG1。经鉴定，结果表明，单克隆抗体3E9的轻链可变区互补决定区1CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：SASSSVNYMH。单克隆抗体3E9的轻链可变区互补决定区2CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，具体为：STSNLAS。单克隆抗体3E9的轻链可变区互补决定区3CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，具体为：QQRNRYPLT。单克隆抗体3E9的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，具体为：QIVLTQSPAFMSASPGEKVTITCSASSSVNYMHWFQQKPGTSPRLCIFSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRNRYPLTFGAGTKLELK。单克隆抗体3E9的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，具体为：MHFQVQIFSFLLISASVIMSKGQIVLTQSPAFMSASPGEKVTITCSASSSVNYMHWFQQKPGTSPRLCIFSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRNRYPLTFGAGTKLELK。亦即单克隆抗体3E9的轻链含有128个氨基酸。单克隆抗体3E9的重链可变区互补决定区1CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，具体为：SYTLH。单克隆抗体3E9的重链可变区互补决定区2CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，具体为：YFNPYNDGIKYNEKFKN。单克隆抗体3E9的重链可变区互补决定区3CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，具体为：ETYDAVDF。单克隆抗体3E9的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，具体为：EVQLQQSGPELLKPGASVKMSCRASGYTFRSYTLHWVKQKPGQGLEWIGYFNPYNDGIKYNEKFKNKAKLTSDKSSSTVYMELNSLTSDDSAVYFCARETYDAVDFWGQGTTLTVSS。单克隆抗体3E9的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示，具体为：MEWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELLKPGASVKMSCRASGYTFRSYTLHWVKQKPGQGLEWIGYFNPYNDGIKYNEKFKNKAKLTSDKSSSTVYMELNSLTSDDSAVYFCARETYDAVDFWGQGTTLTVSS。亦即单克隆抗体3E9的重链含有136个氨基酸。对应地，单克隆抗体3E9的轻链可变区互补决定区1CDR1的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，具体为：AGTGCCAGCTCAAGTGTAAATTACATGCAC。单克隆抗体3E9的轻链可变区互补决定区2CDR2的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，具体为：AGCACATCCAACCTGGCTTCT。单克隆抗体3E9的轻链可变区互补决定区3CDR3的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，具体为：CAGCAAAGGAATCGTTACCCGCTCACG。单克隆抗体3E9的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示，具体为：CAGATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCATTCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATAACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATTACATGCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCACTTCTCCCAGACTCTGCATCTTTAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGTCGAATGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAATCGTTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA。单克隆抗体3E9的轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，具体为：ATGCATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAAAGGACAGATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCATTCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATAACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAATTACATGCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCACTTCTCCCAGACTCTGCATCTTTAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGTCGAATGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAATCGTTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA。亦即单克隆抗体3E9的轻链的核苷酸含有384个碱基。单克隆抗体3E9的重链可变区互补决定区1CDR1核苷酸序列如SEQIDNO.16所示，具体为：AGCTATACTTTGCAC。单克隆抗体3E9的重链可变区互补决定区2CDR2核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，具体为：TATTTTAATCCCTACAACGATGGTATTAAGTACAATGAGAAGTTTAAAAAC。单克隆抗体3E9的重链可变区互补决定区3CDR2核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，具体为：GAGACCTACGACGCGGTTGACTTC。单克隆抗体3E9的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示，具体为：ATGGAATGGAGTTGGATATTTCTCTTTCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGTTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAGGGCTTCGGGATACACATTCAGGAGCTATACTTTGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATTTTAATCCCTACAACGATGGTATTAAGTACAATGAGAAGTTTAAAAACAAGGCCAAACTGACTTCAGACAAATCTTCCAGCACAGTCTACATGGAACTCAACAGCCTGACCTCTGATGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAGACCTACGACGCGGTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA。单克隆抗体3E9的重链的核苷酸序列如SEQIDNO.20所示，具体为：GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGTTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAGGGCTTCGGGATACACATTCAGGAGCTATACTTTGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATTTTAATCCCTACAACGATGGTATTAAGTACAATGAGAAGTTTAAAAACAAGGCCAAACTGACTTCAGACAAATCTTCCAGCACAGTCTACATGGAACTCAACAGCCTGACCTCTGATGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAGACCTACGACGCGGTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA。亦即，单克隆抗体3E9的重链的核苷酸含有351个碱基。单克隆抗体6F8的轻链可变区互补决定区1CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO.21所示，具体为：KASQSVDYDGDSYMN。单克隆抗体6F8的轻链可变区互补决定区2CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.22所示，具体为：DASNLES。单克隆抗体6F8的轻链可变区互补决定区3CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.23所示，具体为：QQSNEDPLT。单克隆抗体6F8的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.24所示，具体为：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYDASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPLTFGGGTRLELK。单克隆抗体6F8的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.25所示，具体为：METDTILLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYDASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPLTFGGGTRLELK。亦即单克隆抗体6F8的轻链含有131个氨基酸。单克隆抗体6F8的重链可变区互补决定区1CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO.26所示，具体为：DYSMH。单克隆抗体6F8的重链可变区互补决定区2CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.27所示，具体为：WINTETGEPTYANDFKG。单克隆抗体6F8的重链可变区互补决定区3CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.28所示，具体为：NYGSSLAY。单克隆抗体6F8的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.29所示，具体为：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASDYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYANDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARNYGSSLAYWGQGTLVTVSS。单克隆抗体6F8的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.30所示，具体为：MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASDYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYANDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARNYGSSLAYWGQGTLVTVSS。亦即单克隆抗体6F8的重链含有136个氨基酸。对应地，单克隆抗体6F8的轻链可变区互补决定区1CDR1的核苷酸序列如SEQIDNO.31所示，具体为：AAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAAC。单克隆抗体6F8的轻链可变区互补决定区2CDR2的核苷酸序列如SEQIDNO.32所示，具体为：GATGCATCCAATCTAGAATCT。单克隆抗体6F8的轻链可变区互补决定区3CDR3的核苷酸序列如SEQIDNO.33所示，具体为：GATGCATCCAATCTAGAATCT。单克隆抗体6F8的轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.34所示，具体为：GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGATGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGCTCACGTTCGGTGGTGGGACCAGGCTGGAGCTGAAA。单克隆抗体6F8的轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.35所示，具体为：ATGGAGACAGACACAATCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGCTCCACTGGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGATGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGCTCACGTTCGGTGGTGGGACCAGGCTGGAGCTGAAA。亦即，单克隆抗体6F8的轻链的核苷酸含有393个碱基。单克隆抗体6F8的重链可变区互补决定区1CDR1的核苷酸序列如SEQIDNO.36所示，具体为：GACTATTCAATGCAC。单克隆抗体6F8的重链可变区互补决定区2CDR2的核苷酸序列如SEQIDNO.37所示，具体为：TGGATAAACACTGAGACTGGTGAGCCAACATATGCAAATGACTTCAAGGGA。单克隆抗体6F8的重链可变区互补决定区3CDR3的核苷酸序列如SEQIDNO.38所示，具体为：AACTACGGTAGTAGCTTGGCTTAC。单克隆抗体6F8的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.39所示，具体为：CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGATTATACCTTCACAGACTATTCAATGCACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGTGAGCCAACATATGCAAATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCTAGAAACTACGGTAGTAGCTTGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCA。单克隆抗体6F8的重链的核苷酸序列如SEQIDNO.40所示，具体为：ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATCCAAGCACAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGATTATACCTTCACAGACTATTCAATGCACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGTGAGCCAACATATGCAAATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCTAGAAACTACGGTAGTAGCTTGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCA。亦即单克隆抗体6F8的重链的核苷酸含有408个碱基。②单克隆抗体腹水效价的检测使用包被缓冲液将检测抗原稀释至一定浓度，每孔50μL包被ELISA板条，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，4℃过夜；将单克隆抗体腹水倍比稀释，每孔50μL，同样倍比稀释SP20腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔50μL，37℃孵育1.5h；PBST洗涤后，OPD显示，酶联检测仪测定OD490的值，以PN值≥2.1为判定标准，测定单克隆抗体腹水效价。结果显示，单克隆抗体3E9和单克隆抗体6F8的效价均达到1：32768000。③单克隆抗体特异性的鉴定以Dot-ELISA鉴定单克隆抗体的特异性，具体步骤如下：剪取一定大小的NC膜，在去离子水中浸透后晾干；用移液器分别吸取工作浓度的rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-ChIFN-γ、rHis-ChIFN-4、rGST-ChIFN-4，以及BL21DE3pET和BL21pGEX-6P-1经IPTG诱导后的超声裂解液上清各5μL点于NC膜上，37℃30min干燥后，用含10％小牛血清的PBST封闭，室温轻摇过夜；PBST洗涤后，在将NC膜浸入细胞培养液上清或稀释的腹水中，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，每次10min，再浸入工作浓度的羊抗鼠HRP-IgG+M酶标抗体溶液中，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次10min，最后DAB显示，蒸馏水终止反应。在Dot-ELISA试验中，单克隆抗体3E9和单克隆抗体6F8只与rBoIFN-γ反应，而不与原核表达的上述其他重组细胞因子和对照菌反应。实施例2牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒的组装牛结核γ-干扰素ELISpot试剂盒组装步骤如下：1生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体记为Bio-6F8的制备：将纯化的单克隆抗体6F8采用标准生物素标记法进行标记，获得生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体Bio-6F8。溶解2～10mg单克隆抗体6F8蛋白于1mL的磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数；平衡生物素至室温，加2mgSulfo-NHS-Biotin于100μL超纯水中，加入一定浓度的生物素；室温30分钟，或冰上放置2小时；用30mLPBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5mL或1mL于单独的管中，以280nm的吸收值测定单克隆抗体蛋白含量。2试剂盒组装将微孔滤膜板例如96孔滤膜板、牛γ干扰素单克隆抗体3E9由保藏号为CCTCCNO：C2017283的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体、生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体Bio-6F8由保藏号为CCTCCNO：C2017282杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体等组份按每个试剂盒数量装载瓶数放入试剂盒塑料支架，包装组装成试剂盒，将说明书放入试剂盒，贴好外标签和侧标签。进一步的，试剂盒中依据需要组装入：亲和素-碱性磷酸酶结合物、NBTBCIP底物显色液、稀释液、洗涤液20×、封闭液、特异性刺激剂例如CE蛋白、阴性对照例如完全1640培养基和阳性对照例如美洲商陆PWM中的一种或多种。试剂盒中，微孔滤膜板、牛γ干扰素单克隆抗体3E9由保藏号为CCTCCNO：C2017283的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体也可采用包被牛γ干扰素单克隆抗体3E9的微孔滤膜板替代。包被牛γ干扰素单克隆抗体3E9的微孔滤膜板的制备方法：①无菌打开96孔滤膜板，20μL孔，35％乙醇，预湿PVDF膜，1min后用PBS清洗3次，250μL孔，1min次。②96孔滤膜板中加入5μgmL的捕获牛γ干扰素单克隆抗体3E9由保藏号为CCTCCNO：C2017283的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体，100μL孔，4℃过夜包被；③弃包被液，使用含有灭菌PBS洗板3次，1min次；④加入含10％胎牛血清的完全1640培养基，200μL孔，37℃孵育封闭2h；⑤弃封闭液，使用PBS洗板1次，37℃干燥2h，加干燥剂将96孔滤膜板一起放于密封袋中，抽真空密封，置4℃保存。3试剂盒使用说明1.取已包被的ELISpot板包被牛γ干扰素单克隆抗体3E9的微孔滤膜板，分别将加入50μL特异性刺激剂例如CE蛋白、阳性对照例如美洲商陆PWM、阴性对照例如完全1640培养基到各孔中。2.加入50μL的待检PBMC加入到各孔中，轻弹酶标板或用微量振荡器振荡，使反应板中的溶液混匀。3.盖上盖子，37℃孵育24-48h。4.用250μL的1×洗液洗涤每个板孔6次，5min次。每次洗涤后，甩去每个板孔中的液体，尽量除去残留的洗液。在加入下一个试剂前，避免孔壁变干。5.酶标抗体使用前瞬离一下，瞬离后用酶标抗体稀释液将稀释酶标抗体稀释至1.5μgmL现配现用。在每孔中加入100μL新鲜配制的酶标抗体，盖上盖子，37℃孵育2h。6.重复步骤4。7.用稀释液1：1000稀释Streptavidin-AKP，每孔中加入100μL新鲜配制的酶，盖上盖子，37℃孵育2h。8.重复步骤4。9.每孔中加入100μL底物显色液，贴上封板膜，37℃避光显色5-10min。10.使用自来水冲洗终止后，37℃过夜烘干。11.使用ELISPOT读板仪计数。表1本发明所涉及试剂盒的组份实施例3基于非特异性刺激原PWM的ELISpot检测试剂盒检测牛外周血样品1.实验材料使用实施例2中制备的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒。2.PBMC分离、孵育及检测①无菌采取5mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；②取一支淋巴细胞分离管平衡至室温，800g离心3min，使分离液全部落入筛板下，打开管盖，用滴管小心将血液样本叠加在筛板上，18-22℃，800g离心20min。离心后，管中液体分为四层，从上到下依次是：黄色清亮的血浆层、云雾状细胞层、无色的分离液层、红细胞层。用吸管小心吸出分离液上层的云雾细胞层，置于另一新的离心管内已加入无血清细胞培养基，混匀后，500g，4℃离心10min。弃上清，用无血清培养基重悬所得细胞，500g，4℃离心10min。弃上清后，用适当体积完全1640重悬，混匀后取适当体积用于计数，其余细胞重悬液盖上离心管盖，置于冰上，备用。③在上述包被牛γ干扰素单克隆抗体3E9的96孔滤膜板中加入下列试剂：每个PBMC样品包括2个试验孔，50μL细胞培养液至阴性对照孔，50μL细胞培养液稀释的PWM至阳性对照孔终浓度为10μgmL，上述每孔加入50μL牛PBMC，将96孔滤膜板置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48h；④将96孔滤膜板取出，弃培养上清，使用PBS洗板5次，5min次，洗板后甩干。加入1.5μgmL的牛γ干扰素检测抗体Bio-6F8，100μL孔，置于37℃孵育2h；⑤用PBS洗板5次，5min次，洗板后甩干，加入1：1000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL孔，置于37℃孵育2h；⑥每孔加入100μL底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3h烘干；⑦使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛γ干扰素的T细胞；或将96孔滤膜板放入ELISpot仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。结果如图1所示。结果显示在检测牛PBMC样品时，阳性对照孔A中出现的有效斑点数显著多于阴性对照孔B，结果表明本发明的试剂盒可用于对牛PBMC进行直接检测，本发明的试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。实施例4基于非特异性刺激原PWM的ELISpot检测试剂盒与以2G5作为包被抗体、Bio-5E11作为检测抗体的牛γ干扰素ELISpot检测方法检测牛外周血样品的比较1.实验材料参照本发明实施例3中的方法来制备牛γ干扰素ELISpot检测试剂盒。不同之处在于：以牛γ干扰素单克隆抗体2G5由保藏号为CCTCCNO：C2012107的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生作为包被抗体、牛γ干扰素单克隆抗体Bio-5E11由保藏号为CCTCCNO：C2012108的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生作为检测抗体。其中所述牛γ干扰素单克隆抗体2G5由保藏号为CCTCCNO：C2012107的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生和牛γ干扰素单克隆抗体5E11由保藏号为CCTCCNO：C2012108的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生公开于授权公布号为CN102965343B的已授权发明专利中。2.以牛γ干扰素单克隆抗体2G5由保藏号为CCTCCNO：C2012107的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生作为包被抗体、牛γ干扰素单克隆抗体Bio-5E11由保藏号为CCTCCNO：C2012108的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生作为检测抗体的牛γ干扰素ELISpot检测方法选择1头健康奶牛，采用以牛γ干扰素单克隆抗体2G5由保藏号为CCTCCNO：C2012107的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生作为包被抗体、牛γ干扰素单克隆抗体Bio-5E11由保藏号为CCTCCNO：C2012108的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生作为检测抗体的牛γ干扰素ELISpot检测方法进行检验。3.牛γ干扰素ELISpot检测试剂盒检测选择上述同1头健康奶牛，使用实施例2中制备的牛γ干扰素ELISpot检测试剂盒使用步骤进行牛γ干扰素检测。将检验结果与以牛γ干扰素单克隆抗体2G5由保藏号为CCTCCNO：C2012107的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生作为包被抗体、牛γ干扰素单克隆抗体Bio-5E11由保藏号为CCTCCNO：C2012108的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生作为检测抗体的牛γ干扰素ELISpot检测方法结果进行比较与分析。结果如图2所示。由图2结果可见，根据图片斑点形态，发现检测抗体Bio-6F8阳性孔斑点数目较Bio-5E11孔斑点数目多，从阴性孔斑点数目观察，捕获抗体2G5阴性孔斑点数目多，本底干扰较3E9大。相比较以2G5由保藏号为CCTCCNO：C2012107的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生作为包被抗体、Bio-5E11由保藏号为CCTCCNO：C2012108的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生作为检测抗体的牛γ干扰素ELISpot检测方法，本发明实施例3中的基于非特异性刺激原PWM的ELISpot检测试剂盒检测的结果图阴性本底干扰小，阳性斑点数目多，斑点形态圆融、背景清晰。实施例5基于非特异性刺激原PWM的ELISpot检测试剂盒与牛结核γ-干扰素ELISA检测试剂盒检测牛外周血单个核细胞样品的比较1.实验材料使用实施例3中制备的牛γ干扰素ELISpot检测试剂盒。ELISA试剂盒MycobacteriumbovisGammaInterferonTestKitforCattle购自ThermoFisher公司。2.ELISA试剂盒检测选择某牛场1头奶牛，采用商品化ELISA试剂盒进行检验。使用分离得到的PBMC为样品，浓度分别为3ⅹ105孔，3ⅹ104孔，3ⅹ103孔，3ⅹ102孔，3ⅹ10孔，每孔设两个复孔。按照试剂盒使用说明书操作并判定结果。3.牛γ干扰素ELISpot检测试剂盒检测选择上述牛场同1头健康奶牛，使用实施例3中制备的牛γ干扰素ELISpot检测试剂盒使用步骤进行牛结核病检测。使用分离得到的PBMC，浓度分别为3ⅹ105孔，3ⅹ104孔，3ⅹ103孔，3ⅹ102孔，3ⅹ10孔，每孔设两个复孔。将检验结果与ELISA试剂盒结果进行比较与分析。结果如表2-1、2-2所示。表2-1ELISpot方法测定结果表2-2ELISA试剂盒测定结果由表2-1，2-2所示结果可见，在相同孵育条件下随着PBMC数目逐渐减少，ELISpot斑点形成数目也相应减少，当PBMC数目减少至3ⅹ104个孔时，ELISpot检测方法任然可以形成斑点80个左右，ELISA方法OD450值已接近阴性控制水平。证明在相同条件下ELISpot检测方法的灵敏度更高于ELISA方法，更适合用于检测活细胞分泌的IFN-γ水平。实施例6基于非特异性刺激原PWM的ELISpot检测试剂盒与Mabtech公司抗体对检测牛外周血样品的比较1.实验材料使用实施例3中制备的牛γ干扰素ELISpot检测试剂盒。ELISA试剂盒MycobacteriumbovisGammaInterferonTestKitforCattle购自ThermoFisher公司。本研究建立的牛γ干扰素ELISpot检测方法与Mabtech公司抗体对MT17.1，MT307检测同一份PBMC的斑点形成效果。Mabtech公司抗体对MT17.1，MT307检测方法按照其说明书进行。结果如图3所示，由图3可以看出，本发明自行建立的ELISpot检测方法阳性孔斑点形成数目较多、阴性孔斑点数目少、阳性阴性斑点数目差异大，斑点形态清晰，背景明亮，具有良好的应用价值。实施例7基于特异性刺激原CE蛋白的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒检测牛外周血样品1.实验材料使用实施例2中制备的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒。2.PBMC的分离①无菌采取5mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；②取一支淋巴细胞分离管平衡至室温，800g离心3min，使分离液全部落入筛板下，打开管盖，用滴管小心将血液样本叠加在筛板上，18-22℃，800g离心20min。离心后，管中液体分为四层，从上到下依次是：黄色清亮的血浆层、云雾状细胞层、无色的分离液层、红细胞层。用吸管小心吸出分离液上层的云雾细胞层，置于另一新的离心管内已加入无血清细胞培养基，混匀后，500g，4℃离心10min。弃上清，用无血清培养基重悬所得细胞，500g，4℃离心10min。弃上清后，用适当体积完全1640重悬，混匀后取适当体积用于计数，其余细胞重悬液盖上离心管盖，置于冰上，备用。3.PBMC的孵育及检测①在上述包被牛γ干扰素单克隆抗体3E9的96孔滤膜板中加入下列试剂：每个PBMC样品包括3个试验孔，50μL细胞培养液至阴性对照孔，50μL细胞培养液稀释的PWM至阳性对照孔终浓度为5μgmL，50μL细胞培养液稀释的特异性刺激原CE蛋白至试验孔终浓度为10μgmL。上述每孔加入50μL牛PBMC，将96孔滤膜板置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48h；②将96孔滤膜板取出，弃培养上清，使用PBS洗板5次，5min次，洗板后甩干。加入1.5μgmL的牛γ干扰素检测抗体Bio-6F8，100μL孔，置于37℃孵育2h；③用PBS洗板5次，5min次，洗板后甩干，加入1：1000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL孔，置于37℃孵育2h；④每孔加入100μL底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3h烘干；⑤使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛γ干扰素的T细胞；或将96孔滤膜板放入ELISpot仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。3.试验有效的条件PWM阳性对照孔中斑点数大于阴性对照孔中斑点数，且阳性质控PWM阳性对照孔中斑点数20，判定本试验有效。4.牛结核病结果判定①如果阴性对照孔中斑点数5，CE蛋白检测孔中斑点数减去阴性对照孔中斑点数6时；②如果阴性对照孔中斑点数6，CE蛋白检测孔中斑点数2倍阴性对照孔中斑点数时；出现以上任一检测结果，判定为牛结核病阳性，反之则判为阴性。结果如图4所示。结果表明本发明的试剂盒可以对结核病阳性牛外周血中分泌牛γ干扰素的T淋巴细胞进行有效检测，阳性质控PWM阳性对照孔中斑点数20A，CE蛋白检测孔中斑点数2倍阴性对照孔中斑点数B，C，本发明的试剂盒可以进行牛结核病的检测，具有较好的灵敏度和特异性。实施例8基于CE蛋白的牛结核病ELISpot检测试剂盒与比较皮内变态反应试验的比较1.实验材料使用实施例2中制备的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒。比较皮内变态反应试验使用的牛型PPD、禽型PPD购自中国兽医药品监督所。2.比较皮内变态反应试验选择36头奶牛，进行比较皮试变态反应试验，比较皮试变态反应按照国标方法GBT18645-2002进行。3.牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒检测选择上述36头奶牛，使用实施例7中制备的牛结核病ELISpot检测试剂盒使用步骤进行牛结核病检测。将检验结果与比较皮试变态反应试验结果进行比较与分析，如表3所示。表3.基于CE蛋白的牛结核病ELISpot检测试剂盒结果与比较皮试变态反应试验结果比较单位：头共检测36头牛，将两种试剂盒检测出来共同阳性牛数[ELISA试剂盒检测出的阳性牛数+ELISpot检测试剂盒检测出的阳性牛数2]计算出阳性符合率；将两种试剂盒检测出来共同阴性牛数[ELISA试剂盒检测出的阴性牛数+ELISpot检测试剂盒检测出的阴性牛数2]计算出阴性符合率。将两种试剂盒共同检测出的阳性牛数+共同检测出的阴性牛数总共检测牛数，计算出总符合率。经统计学分析，基于CE蛋白进行的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒与皮试变态反应结果的阳性符合率为76.9％，阴性符合率为72.7％，总符合率为75％，具有良好的检测效果，显示其在牛结核病诊断中具有较好的诊断价值。实施例9基于CE蛋白的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒与牛结核γ-干扰素ELISA检测试剂盒的比较1.实验材料使用实施例2中制备的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒。ELISA试剂盒MycobacteriumbovisGammaInterferonTestKitforCattle购自ThermoFisher公司。地点：江苏某牛场。时间：2017年10月。试验头数：36头。本试验检测了临床奶牛PBMC样品，并且与市售ELISA试剂盒进行对比，以进一步确认CE蛋白作为牛结核病ELISpot检测试剂盒刺激原的效果。牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒检测牛外周单个核细胞样品的结果判定同实施例7所述，结果如表4所示。表4.基于CE蛋白的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒结果与ELISA试剂盒结果比较单位：头“+”代表阳性，“－”代表阴性共检测36头结核疑似牛，以ELISA试剂盒检验结果作为参考，以该试剂盒检测为阳性的奶牛判定为牛结核阳性，该试剂盒检测为阴性的奶牛判定为牛结核阴性。将两种试剂盒检测出来共同阳性牛数[ELISA试剂盒检测出的阳性牛数+ELISpot检测试剂盒检测出的阳性牛数2]计算出阳性符合率；将两种试剂盒检测出来共同阴性牛数[ELISA试剂盒检测出的阴性牛数+ELISpot检测试剂盒检测出的阴性牛数2]计算出阴性符合率。将两种试剂盒共同检测出的阳性牛数+共同检测出的阴性牛数总共检测牛数，计算出总符合率。经统计学分析，基于CE蛋白进行的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒与ELISA试剂盒结果的阳性符合率为88.2％，阴性符合率为89.5％，总符合率为88.9％，具有良好的检测效果，显示其在牛结核病诊断中具有较好的诊断价值。实施例10基于CE蛋白的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒与牛结核病抗体检测试剂盒的比较1.实验材料使用实施例2中制备的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒。牛结核病抗体检测试剂盒购自韩国安捷公司。2.牛结核病抗体试剂盒检测选择某结核阳性牛场10头PPD检测阳性奶牛，采用牛结核病抗体试剂盒进行检验，按照试剂盒使用说明书操作并判定结果。3.牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒检测选择某结核阳性牛场10头PPD检测阳性奶牛奶牛，使用实施例7中制备的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒使用步骤进行牛结核病检测。将检验结果与牛结核病抗体试剂盒结果进行比较与分析。结果如表5所示。表5基于CE蛋白的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒结果与牛结核病抗体试剂盒结果比较单位：头经统计学分析，基于CE蛋白进行的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒与牛结核病抗体检测试剂盒结果的阳性符合率为36.4％，阴性符合率为22.2％，总符合率为30.0％，显示ELISpot检测试剂盒在牛结核病诊断中具有良好的诊断价值。实施例11基于CE蛋白的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒与基于PPD的牛结核γ干扰素ELISpot检测方法的比较1.实验材料使用实施例2中制备的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒。基于PPD的牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法徐正中,等.牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法的建立.生物工程学报,2015,312:183-194。2.基于PPD的牛结核γ干扰素ELISpot检测方法选择某结核阳性牛场健康奶牛和结核阳性牛，采用基于PPD的牛结核γ干扰素ELISpot检测方法进行检验。3.牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒检测选择1头健康奶牛和1头结核阳性牛，使用实施例7中制备的牛结核病ELISpot检测试剂盒使用步骤进行牛结核病检测。将检验结果与基于PPD的牛结核γ干扰素ELISpot检测方法结果进行比较与分析。结果如图5所示。结果显示，在结牛血检测图中，CE蛋白作为特异性刺激剂和PPD作为刺激剂，都有斑点形成。而在健康牛血检测图中，CE蛋白作为特异性刺激剂时，不会有斑点形成，而由于PPD成分复杂，包含的很多蛋白同时存在于致病分枝杆菌和环境非致病分枝杆菌中，不能区分结核阳性感染、免疫个体以及环境分枝杆菌感染等情况，血清学检测时经常出现交叉反应，从而特异性受到一定程度影响，健康牛血有斑点形成。因此基于CE蛋白的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒排除了该方面的干扰，显示其具有良好的特异性。具有良好的检测效果，显示其在牛结核病诊断中具有较好的诊断价值。实施例12基于CE蛋白的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒检测无结核病牛群1.实验材料使用实施例2中制备的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒。2.牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒检测选择无结核病牛群，使用实施例7中制备的牛结核病ELISpot检测试剂盒使用步骤进行牛结核病检测。所有实验奶牛为牛结核病净化牛群，共17头。结果如表7所示。表7.无结核病牛群检测结果“+”代表阳性，“－”代表阴性结果显示，在结核病净化牛群中，基于CE蛋白的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒特异性为100％。能较好的区分结核阳性感染、免疫个体以及环境分枝杆菌感染等情况，血清学检测时经常出现交叉反应，显示其具有良好的特异性。实施例13基于CE蛋白的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒检测皮试阳性牛结核IFN-γ阴性牛群1.实验材料使用实施例2中制备的牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒。2.牛结核γ-干扰素ELISpot检测试剂盒检测选择皮试阳性牛结核IFN-γ阴性牛群，使用实施例7中制备的牛结核病ELISpot检测试剂盒使用步骤进行牛结核病检测，共4头实验奶牛。结果如表8所示。表8.皮试阳性牛群检测结果结果显示，在皮试阳性牛群中使用牛结核病ELISpot检测试剂盒进行检测，阴性对照控制在5个以下，阳性刺激组刺激形成的斑点大于20个，试验成立。与此同时CE蛋白刺激形成的斑点小于5个，说明检测结果为阴性牛群。综上所述，本发明的发明人用夹心ELISA方法，以美洲商陆丝裂原PWM刺激制备的含天然BoIFN-γ的阳性血浆作为筛选抗原，通过BoIFN-γ单抗与多抗夹心ELISA试验，从至少43株BoIFN-γ单抗中，筛选得到捕获天然BoIFN-γ能力较好的4株单抗和检测天然BoIFN-γ能力较好的6株单抗。用ELISpot方法，对ELISA结果中对天然BoIFN-γ结合能力较好的4株捕获抗体和6株检测抗体，两两方阵组合。4株捕获抗体分别作为ELISpot方法中的包被抗体，6株生物素标记的检测抗体分别作为ELISpot方法中的检测抗体，形成24个抗体对组合，进行ELISpot试验，得到斑点形成数目较多的9个抗体对组合。接着将该9个抗体对组合与瑞典MABTECHAB公司的BovineIFN-γELISpot抗体对MT17.1,MT307同步比较，根据ELISpot试验结果中的阳性孔斑点形成数目较多、阴性孔斑点数目少、阳性阴性斑点数目差异大，斑点形态清晰，背景明亮等原则。最终选择单抗3E9和Bio-6F8分别作为牛γ干扰素ELISpot检测方法的捕获抗体和检测抗体。本发明对至少43株BoIFN-γ单抗进行筛选，最终仅有7株对天然BoIFN-γ表现出较强的免疫反应性，表明这些单抗中的大部分并不具备识别天然BoIFN-γ表位的能力。最终选择单抗3E9和Bio-6F8分别作为牛γ干扰素ELISpot检测方法的捕获抗体和检测抗体，付出了大量创造性劳动。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。序列表110扬州大学120一种用于检测牛结核病的ELISpot检测试剂盒13018209416040170SIPOSequenceListing1.0210121110212PRT213人工序列ArtificialSequence4001SerAlaSerSerSerValAsnTyrMetHis151021022117212PRT213人工序列ArtificialSequence4002SerThrSerAsnLeuAlaSer1521032119212PRT213人工序列ArtificialSequence4003GlnGlnArgAsnArgTyrProLeuThr152104211106212PRT213人工序列ArtificialSequence4004GlnIleValLeuThrGlnSerProAlaPheMetSerAlaSerProGly151015GluLysValThrIleThrCysSerAlaSerSerSerValAsnTyrMet202530HisTrpPheGlnGlnLysProGlyThrSerProArgLeuCysIlePhe354045SerThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrIleSerArgMetGluAlaGlu65707580AspAlaAlaThrTyrTyrCysGlnGlnArgAsnArgTyrProLeuThr859095PheGlyAlaGlyThrLysLeuGluLeuLys1001052105211128212PRT213人工序列ArtificialSequence4005MetHisPheGlnValGlnIlePheSerPheLeuLeuIleSerAlaSer151015ValIleMetSerLysGlyGlnIleValLeuThrGlnSerProAlaPhe202530MetSerAlaSerProGlyGluLysValThrIleThrCysSerAlaSer354045SerSerValAsnTyrMetHisTrpPheGlnGlnLysProGlyThrSer505560ProArgLeuCysIlePheSerThrSerAsnLeuAlaSerGlyValPro65707580AlaArgPheSerGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrIle859095SerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGlnGlnArg100105110AsnArgTyrProLeuThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGluLeuLys11512012521062115212PRT213人工序列ArtificialSequence4006SerTyrThrLeuHis15210721117212PRT213人工序列ArtificialSequence4007TyrPheAsnProTyrAsnAspGlyIleLysTyrAsnGluLysPheLys151015Asn21082118212PRT213人工序列ArtificialSequence4008GluThrTyrAspAlaValAspPhe152109211117212PRT213人工序列ArtificialSequence4009GluValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuLeuLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysArgAlaSerGlyTyrThrPheArgSerTyr202530ThrLeuHisTrpValLysGlnLysProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTyrPheAsnProTyrAsnAspGlyIleLysTyrAsnGluLysPhe505560LysAsnLysAlaLysLeuThrSerAspLysSerSerSerThrValTyr65707580MetGluLeuAsnSerLeuThrSerAspAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaArgGluThrTyrAspAlaValAspPheTrpGlyGlnGlyThrThr100105110LeuThrValSerSer11521010211136212PRT213人工序列ArtificialSequence40010MetGluTrpSerTrpIlePheLeuPheLeuLeuSerGlyThrAlaGly151015ValHisSerGluValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuLeuLys202530ProGlyAlaSerValLysMetSerCysArgAlaSerGlyTyrThrPhe354045ArgSerTyrThrLeuHisTrpValLysGlnLysProGlyGlnGlyLeu505560GluTrpIleGlyTyrPheAsnProTyrAsnAspGlyIleLysTyrAsn65707580GluLysPheLysAsnLysAlaLysLeuThrSerAspLysSerSerSer859095ThrValTyrMetGluLeuAsnSerLeuThrSerAspAspSerAlaVal100105110TyrPheCysAlaArgGluThrTyrAspAlaValAspPheTrpGlyGln115120125GlyThrThrLeuThrValSerSer1301352101121130212DNA213人工序列ArtificialSequence40011agtgccagctcaagtgtaaattacatgcac302101221121212DNA213人工序列ArtificialSequence40012agcacatccaacctggcttct212101321127212DNA213人工序列ArtificialSequence40013cagcaaaggaatcgttacccgctcacg2721014211318212DNA213人工序列ArtificialSequence40014cagattgttctcacccagtctccagcattcatgtctgcatctccaggggagaaggtcacc60ataacctgcagtgccagctcaagtgtaaattacatgcactggttccagcagaagccaggc120acttctcccagactctgcatctttagcacatccaacctggcttctggagtccctgctcgc180ttcagtggcagtggatctgggacctcttactctctcacaatcagtcgaatggaggctgag240gatgctgccacttattactgccagcaaaggaatcgttacccgctcacgttcggtgctggg300accaagctggagctgaaa31821015211384212DNA213人工序列ArtificialSequence40015atgcattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtcataatgtcc60aaaggacagattgttctcacccagtctccagcattcatgtctgcatctccaggggagaag120gtcaccataacctgcagtgccagctcaagtgtaaattacatgcactggttccagcagaag180ccaggcacttctcccagactctgcatctttagcacatccaacctggcttctggagtccct240gctcgcttcagtggcagtggatctgggacctcttactctctcacaatcagtcgaatggag300gctgaggatgctgccacttattactgccagcaaaggaatcgttacccgctcacgttcggt360gctgggaccaagctggagctgaaa3842101621115212DNA213人工序列ArtificialSequence40016agctatactttgcac152101721151212DNA213人工序列ArtificialSequence40017tattttaatccctacaacgatggtattaagtacaatgagaagtttaaaaac512101821124212DNA213人工序列ArtificialSequence40018gagacctacgacgcggttgacttc2421019211408212DNA213人工序列ArtificialSequence40019atggaatggagttggatatttctctttctcctgtcaggaactgcaggtgtccactctgag60gtccagctg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权利要求：1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链包括氨基酸序列如SEQIDNO.1～3所示的CDR区，所述重链包括氨基酸序列如SEQIDNO.6～8所示的CDR区。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.4或其保守型变异序列，其重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.9或其保守型变异序列。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体，由保藏号为CCTCCNO：C2017283的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。4.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链包括氨基酸序列如SEQIDNO.21～23所示的CDR区，所述重链包括氨基酸序列如SEQIDNO.26～28所示的CDR区。5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.24或其保守型变异序列，其重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.29或其保守型变异序列。6.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体，由保藏号为CCTCCNO：C2017282的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。7.如权利要求1-3之任一项所述单克隆抗体或如权利要求4-6之任一项所述单克隆抗体在制备牛疫病的检测试剂或诊断试剂中的用途。8.一种牛γ干扰素的ELISpot检测试剂盒，所述试剂盒包括：1选自以下任一：1支持介质和捕获抗体；2包被有捕获抗体的支持介质；所述捕获抗体为第一单克隆抗体，所述第一单克隆抗体为如权利要求1-3之任一项所述单克隆抗体；2检测抗体；所述检测抗体为经过标记的第二单克隆抗体。9.根据权利要求8所述的牛γ干扰素的ELISpot检测试剂盒，其特征在于，所述第二单克隆抗体为不同于所述第一单克隆抗体的牛γ干扰素单克隆抗体。10.根据权利要求8所述的牛γ干扰素的ELISpot检测试剂盒，其特征在于，所述第二单克隆抗体为如权利要求4-6之任一项所述单克隆抗体。11.根据权利要求8所述的牛γ干扰素的ELISpot检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体为生物素标记或碱性磷酸酶标记的第二单克隆抗体。12.根据权利要求8所述的牛γ干扰素的ELISpot检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：1亲和素-碱性磷酸酶结合物；2底物显色液；3稀释液；4洗涤液；5封闭液；6阴性对照；7阳性对照；8特异性刺激剂；9非特异性刺激剂。13.根据权利要求12所述的ELISpot检测试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：1所述特异性刺激剂为CE蛋白；2所述非特异性刺激剂为PWM。14.如权利要求8-13之任一项所述ELISpot检测试剂盒在非诊断目的牛结核分枝杆菌感染检测中的应用。15.一种分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCCNO：C2017283。16.一种分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNO：C2017282。17.如权利要求15所述的分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株和或如权利要求16所述的分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备牛疫病的检测试剂或诊断试剂中的用途。18.如权利要求15所述的分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株和或如权利要求16所述的分泌牛γ干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备牛γ干扰素的ELISpot检测试剂盒中的用途。

百度查询： 扬州大学 一种用于检测牛结核病的ELISpot检测试剂盒