申请/专利权人：南京林业大学

申请日：2019-04-09

公开（公告）日：2021-03-23

公开（公告）号：CN109929852B

主分类号：C12N15/29(20060101)

分类号：C12N15/29(20060101);C07K14/415(20060101);C12N15/82(20060101);A01H5/00(20180101);A01H6/00(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.03.23#授权;2019.07.19#实质审查的生效;2019.06.25#公开

摘要：本发明公开了一种杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9及其应用。该杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9的DNA序列如SEQIDNO.1所示。本发明克隆出杂交鹅掌楸的LhHB9基因的cDNA序列，构建LhHB9基因的过表达载体，以杂交鹅掌楸胚性愈伤为受体材料，采用农杆菌介导法进行遗传转化。经G418筛选得到转基因愈伤后，对其进行检测，初步确定转基因成功。通过对LhHB9基因转基因愈伤体胚诱导发现，转基因体胚胚根有明显的伸长，统计数据显示，35S：LhHB9体细胞胚胚根与对照CK相比最显著，说明过表达靶基因可以促进胚根的伸长，具有很好的实用性。

主权项：1.杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9，其DNA序列如SEQIDNO.1的第110-2665位所示。

全文数据：杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9及其应用技术领域本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9及其应用。背景技术植物体细胞胚发生简称“体胚发生”是指体细胞在离体条件下产生新个体的过程。Steward在1958年首次利用胡萝卜悬浮系获得体细胞胚。此后，多个物种通过体胚再生途径获得完整植株。体胚发生在植物中是一个普遍现象，利用不同的器官、组织加上合适的外界条件，大部分都能诱导体胚再生。由于合子胚深埋于胚囊之中，且具有个体较小、数量少、发育不一致等特点，因此很难对早期合子胚进行深入细致地研究。而体胚发生过程与合子胚发生类似，体胚发生的人为可操作性和环境的易控制性，使得体胚发生系统成为研究植物早期合子胚发生的优良替代系统。许多重要树种已经通过体胚发生技术实现了工程育苗的产业化，这项技术不仅能实现快速繁殖，而且已逐渐成为研究者们研究植物发育机理、基因表达调控，进行品种改良不可多得的优良体系，在理论和应用中具有重大的意义。杂交鹅掌楸是我国特有的用材和造林树种，其体胚发生研究受到了极大地重视。前期本申请人对于杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生研究已经取得了重要的进展。植物体胚发生是一个复杂、精细的过程，不仅仅受外部条件的影响，还受多种内部机制的调控，如基因调控、激素调控、信号转导调控及miRNA调控等。miRNA普遍存在于植物基因组中，是一类大小约为21～23个核苷酸的非编码RNA分子。其主要在转录后水平上通过与靶基因互补结合介导靶mRNA的剪切或抑制靶分子的翻译来调节基因的表达，从而调控叶形态发生和极性、根系发育、合子胚早期胚胎模式形成及胁迫响应等。与体胚发生相关的miRNAs主要有miR156、miR159、miR160、miR161、miR164、miR165、miR166、miR167、miR168、miR171、miR319、miR390及miR394[110]等，如在拟南芥中过表达miR167会抑制体胚形成，表明其负向调节体胚发生。这种作用主要表现为胚性愈伤中生长素响应和局部生长素运输的改变。关于miRNAs在杂交鹅掌楸体胚发生中的调控研究较少，仅见李婷婷结合高通量测序和miRNA微流体芯片杂交发现参与这一发育过程的miRNA种类，并对miR397及其靶基因进行了生物学初探。发明内容发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一张杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9，满足体胚发生的使用需求。本发明的另一目的是提供一种上述杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9的应用。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。所述的杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。含有所述的杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9的表达载体、宿主菌。所述的杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9在体胚发生中的应用。所述的杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9的在促进体胚胚根伸长中的应用。有益效果：与现有技术相比，本发明克隆出杂交鹅掌楸的LhHB9基因的cDNA序列，构建LhHB9基因的过表达载体，以杂交鹅掌楸胚性愈伤为受体材料，采用农杆菌介导法进行遗传转化。经G418筛选得到转基因愈伤后，对其进行检测，初步确定转基因成功。通过对LhHB9基因转基因愈伤体胚诱导发现，转基因体胚胚根有明显的伸长，统计数据显示，35S：LhHB9体细胞胚胚根与对照CK相比最显著，说明过表达靶基因可以促进胚根的伸长，具有很好的实用性。附图说明图1是抗性愈伤筛选及增殖结果图；图中，注：A：抗性愈伤的筛选；B：抗性愈伤的增殖；图2是目的基因的PCR扩增电泳图；图中，M：M15000，条带分别为15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，1000bp，250bp；CK+：阳性对照；CK-：阴性对照WT；图3是杂交鹅掌楸转基因体细胞胚图；图中：A：非转基因体胚；B：非转基因体胚仅在诱导培养基I中加入100mgL头孢抗生素处理；C：35S：LhHB9；图4是转基因与非转基因体胚胚根统计结果图；图中：A.胚根根长统计图，Duncan法在P＜0.01水平检测极显著差异；B：CK；C：35S：LhHB9。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。实施例1LhHB9基因克隆1、提取杂交鹅掌楸RNA以杂交鹅掌楸叶片为材料，提取RNA，具体步骤为：1使用液氮充分预冷研钵至液氮加入研钵不再沸腾为止；2将不多于50mg植物组织放入盛有液氮的研钵内充分研磨2-3次；3待液氮部分挥发而样品未融解时，加入1mL裂解液，继续研磨至样品与裂解液完全混匀，放在室温下自然融化成匀浆；4用移液枪将匀浆转移至2mL离心管中；5室温，12000rmin离心2分钟，吸取上层液体移至新管；6加入等体积24∶1，涡旋混匀，12000rmin离心2分钟，吸取最上层液体移至新管，记录液体体积；7加入等体积70％乙醇，颠倒混匀30次，将混合液移至收集柱中，12000rmin离心1分钟，弃滤液，剩余混合液冰上保存至全部过柱；8加400μLWashSolution，12000rmin离心1分钟，弃滤液，放回收集管；9提前配制DNA消化酶，加100μL于收集柱中，4000rmin离心1min；离心后，将步骤8所得滤液重新转移至收集柱上，25～30℃静置15min；10加400μLWashSolution至收集柱中，14000rmin离心1min，弃滤液，放回收集柱；11重复步骤10；1214000rmin2min，彻底甩干收集柱，弃掉收集管；13将收集柱置于新的1.7mL洗脱管中Kit提供；14加入50μLElutionSolution于收集柱中；15200～2000rpm离心2min，接着14000rmin离心1min；16用Nanodrop2000定量检测RNA浓度，用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。2、反转录获得cDNA提取的RNA，经过Vazyme公司的HiScriptII1stStrandcDNASynthesisKit试剂盒反转录获得cDNA，具体反转录体系用于PCR引物如下：LhHB9-F：5′-CTTCTGTTTTGGTGGTTTTCTTGGG-3′；LhHB9-R：5′-GTCCTCTACCTACATTGGCTATCTT-3′。过程为：1RNA模板变性，混合液：RNasefreeddH2O补充到8μL，1μLOligodT23VN50μM，1pg-5μgTotalRNA。65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。2cDNA合成，反应液：步骤1的混合液8μL，10μL2×RTMix，2μLHiScriptIIEnzymeMix：用移液枪轻轻吹打混匀。反应程序：25℃5min，50℃45min，85℃2min。以此cDNA为模板，进行后续的PCR。3、PCR以上述cDNA为模板，采用高保真的KODFX酶进行PCR扩增，体系为：2×PCRbuffer10μL，2mMdNTPs4μL，LhHB9-F10μM0.620μL，LhHB9-R10μM0.620μL，TemplateDNA≥120μL，KODFX1.0UμL0.420μL，Distilledwater补充20μL。PCR反应条件如下：94℃2min；98℃10s，Tm-5℃30s，68℃30skbp，35cycles；4℃保存。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳跑胶检测，对目的条带进行切胶回收。4、目的片段切胶回收取少量PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测后，如为预测大小的目的条带，重新做胶，电泳后切胶回收，用QIAGEN公司的QIAquickGelExtractionKit50试剂盒回收纯化PCR扩增产物。具体步骤为：在紫外灯下切下含有目的片段的凝胶，用纸巾吸掉表面液体并切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；加入3倍体积的bufferQG，于50℃下溶解，期间每隔2-3min涡旋助熔，直至凝胶完全熔化；加入1倍体积的异丙醇，颠倒混匀；将上一步的混合液加入到spincolumn置于2mL离心管中，13000rpm1min，弃滤液，若混合液多于800μL可多次过柱；加入750μLBufferPE，13000rpm1min，弃滤液；空离2min，除去残留的washbuffer；将QIAquickcolumn置于干净的1.5mL离心管中，向膜中央加入50μL的BufferEB10mMTris·Cl，pH8.5，离心1min，洗脱DNA。5、载体连接采用Takara公司的T-VectorpMDTM19Simple进行连接反应，10μL连接体系与程序为：3μLddH2O，1μLT-VectorpMDTM19Simple，1μL纯化回收的PCR产物，5μLSolutionI。反应条件：16℃30min。6、大肠杆菌的转化此次转化所用的大肠杆菌感受态为购自TIANGEN公司的DH5α感受态细胞CB101，具体转化步骤为：取感受态细胞于冰上融化；取2μL连接产物加入到100μLDH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；于42℃水浴中放置90sec，快速转移到冰上静置3min，该过程不要晃动离心管；加入800μLLB培养基无抗生素，37℃，150rpm45min复苏；4000rpm离心2min，吸掉上层800μL培养基，重悬剩余菌液；将菌液涂布于含有相应抗生素的LB固体培养板上，37℃倒置，过夜培养。7、菌液PCR检测和测序从筛选培养板上挑取6个单菌落于LB液体培养基含相应抗生素中，37℃，250rpm12-16h，对摇出来的菌液进行PCR检测，菌液PCR的反应体系及反应程序同上，其中反应循环数为35cycles。将电泳检测为阳性的菌液随机挑选3个送金斯瑞生物科技有限公司测序。获得基因序列如SEQIDNO.1所示含非编码序列，命名为LhHB9基因，其表达的蛋白如SEQIDNO.2所示。实施例2LhHB9基因功能验证1、LhHB9过表达载体构建靶基因及靶基因突变体瞬时表达载体构建所用基础载体为PJIT166。此次载体构建采用同源重组的方法。所用试剂为NEB的Gibson预混液，整个组装流程见NEB网站https：www.neb.comapplicationscloning-and-synthetic-biologydna-assembly-and-cloninggibson-assembly。1PCR产生插入片段运用NEBuilder在线网站http：nebuilder.neb.com设计引物，引物序列如下：PJIT166-LhHB9F：5′-ggagaggacagcccaagcttATGGCGCTTGCGATGCAC-3′，PJIT166-LhHB9R：5′-gctcaccatggatcctctagaAAGAAAAGACCAGTTCATGAACAAGAAGGC-3′。以靶基因与T-VectorpMDTM19Simple测序正确的阳性质粒为模板，采用NEB的Q5酶进行PCR，具体的反应体系：Q5High-Fidelity2×MasterMix25μL，10μMForwardPrimer2.5μL，10μMReversePrimer2.5μL，TemplateDNAvariable，Nuclease-FreeWater补充50μL。反应程序：98℃30s；98℃10s，68℃30s，72℃20-30skb，72℃2min，32循环；4℃，保存。反应产物通过1％凝胶电泳跑胶，切胶回收，具体方法见同实施例1。2PJIT166载体的线性化以PJIT166质粒为模板，利用HindIII和XbaI对其进行双酶切，酶切体系如下：DNA1μg，10×CutSmartBuffer5μL，HindIII-HF1μL，XbaI1μL，Nuclease-Free补充至50μL，在37℃孵育5-15min。使用现配25：24：1酚：氯仿：异戊醇进行酶切纯化；若酶切体系小于300μL，加TE补至300μL；等体积混合25∶24∶1，剧烈振荡数次，12000rpm离心2min；取上清至另一干净的1.5mL离心管中，重复步骤3，记录上清体积；加入等体积的24∶1，剧烈振荡，12000rpm离心2min；取上清至另一干净的1.5mL离心管中，重复步骤5，记录上清体积；加入19体积3MNaAc，颠倒混匀；加入2倍上清和NaAc体积的-20℃冷冻无水乙醇，-20℃至少30min；12000rpm，0℃30min，倒上清；700μL70％酒精清洗，12000rpm，5min，4℃，超净工作台吹干，20μLddH2O溶解。3连接反应采用NEB公司的Gibson预混液进行组装，具体体系如下：TotalAmountofFragments0.02-0.5pmolsXμL，GibsonAssemblyMasterMix2X10μL，DeionizedH2O10-XμL，总体积20μL。反应条件：50℃15min。反应结束后，将产物转化DH5α，挑单菌落菌液PCR，送测。靶基因过表达载体构建方法同上，所用的基础载体为PBI121，PCR制备插入片段所用的引物序列如下：PBI121-LhHB9-F：5′-ggagagaacacgggggactctagaggatccATGGCGCTTGCGATGCAC-3′；PBI121-LhHB9-R：5′-ttgaacgatcggggaaattcgagctcTCAAAGAAAAGACCAGTTCATGAACAAGAAGG-3′。2、遗传转化1转化受体的建立受体材料选用继代15～20d的胚性愈伤组织，此时的愈伤组织长势良好，生理状态佳，可以直接用于转化。2重组质粒转化农杆菌本实施例转化靶基因阳性重组质粒所用的菌株为根癌农杆菌菌株EHA105株系，采用热激法进行转化，具体步骤如下：将农杆菌感受态于冰上融化，取3μL测序正确的重组质粒于200μL感受态中，轻弹混匀，冰浴30min；液氮速冻1min，37℃热击3min，迅速置于冰上2min；加800μLLB无抗生素液体培养基，28℃100rpm，2-4h；4000rpm离心2min，去掉800μL上清，将剩下的菌液重悬，涂布于含有相应抗生素的LB固体培养基上；28℃倒置培养30-48h，直至长出单菌落；PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。3农杆菌菌液制备1从活化的LB培养平板上挑取经PCR检测后的阳性单菌落，接种到10mL含相应抗生素的LB液体培养基上，28℃、220rmin振荡培养；2约20h后，吸取2mL菌液，接种到50mL含有相应抗生素的LB液体培养基上，28℃、220rmin振荡培养至OD600值为0.6-0.8；3将菌液分装于50mL离心管，于5000rmin，4℃离心2min，去上清，收集菌体；4用杂交鹅掌楸M13液体继代培养基重悬菌体，至OD600为0.5左右。4侵染及共培养将愈伤组织用镊子碾开，使其分散开来，浸泡在制备好的菌液中10～15min，然后用150目的无菌细胞筛将菌液过滤，再将细胞筛中的愈伤组织挑取到加有100μmolL乙酰丁香酮的M13固体培养基上，暗培养2-3d，即为共培养。5脱菌与抗性筛选共培养后主要通过洗菌和添加适量的头孢霉素来达到抑菌的效果。将胚性愈伤组织挑取到100mL三角瓶中，用添加头孢霉素的M13液体培养基和无菌水交替清洗，一般清洗3-4次，清洗时间不超过10min，清洗完液体是透亮的，最后用150目无菌细胞筛过筛，尽可能的滤干液体，将筛子上的愈伤组织挑取到加有300mgL的M13固体培养基上培养，待20d以后，将其转移到加有200mgL头孢霉素和90mgLG418的M13固体继代培养基上培养，延迟筛选。等抗性愈伤长出，转移到新的加有100mgL头孢霉素和90mgLG418的M13固体继代培养基上继续筛选培养，直到抗性稳定。在经过共培养和抗性筛选后，非转基因愈伤大部分变成褐色、生长受到严重抑制，而转基因愈伤从褐化的非转基因愈伤团中生长出来图1。最终从转靶基因的愈伤组织中获得抗性细胞系，将获得的转基因愈伤组织转接到新的添加G418抗生素的筛选培养基上，进行后期的扩繁。6转基因愈伤组织PCR检测采用农杆菌介导的方法，成功的将靶基因导入杂交鹅掌楸胚性愈伤组织，经过抗性筛选都获得了抗性愈伤组织，在经G418多次筛选后，抗性依然稳定。将转基因愈伤组织扩繁后取材，用于基因组DNA的提取。对转LhHB9的转基因愈伤组织采用35S-F：TGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTG35S启动子上的一段序列和基因特异性下游引物进行PCR验证图2。结果在转基因愈伤和阳性重组质粒中扩增出大小一致的条带，而在非转基因愈伤和水中未能扩出目的条带，初步验证转基因成功。从图2可以看出，经过G418多次筛选后，转基因愈伤阳性率很高。对于转LhHB9的转基因愈伤组织，从上述验证过的阳性细胞系中随机选取3个，建立悬浮体系，通过体胚分化培养基诱导体细胞胚。提取体细胞胚的基因组DNA，并用上述引物进行PCR验证，最后得到了与愈伤组织同样的PCR结果。说明T-DNA没有丢失，在植物中比较稳定。7过表达LhHB9体细胞胚的表型观察将验证阳性的转LhHB9的转基因愈伤与非转基因愈伤组织同时建立悬浮细胞系，在诱导培养基I34MS+2，4-D2.0mgL+BA0.2mgL+CH0.5gL+Vc5mgL+蔗糖30gL，pH5.7-5.8上培养黑暗，23±2℃，转速95rmin21d以后用400目的细胞筛进行过筛，经诱导培养基II34MS+NAA0.2mgL+BA0.2mgL+KT0.5mgL+CH0.5gL+Vc5mgL+蔗糖50gL，pH5.7-5.8培养黑暗，23±2℃，转速95rmin两天后，转到体胚分化培养基34MS+ABA2.0mgL+LH0.2gL+Vc5mgL+Ac2gL+蔗糖40gL+Agar2.4gL，pH5.7-5.8上进行体胚诱导黑暗，23±2℃，培养4周，转移至16h光照8h黑暗培养2周，转瓶。对培养45d左右的转基因体胚进行表型观察，每个样本三皿重复，每皿随机选取90个单胚进行计数统计，取平均值。在体式显微镜下进行形态观察与拍照。过表达靶基因对愈伤组织的生长发育没有什么影响，依然生长旺盛。将转基因愈伤和非转基因愈伤同时诱导体胚，观察它们的形态发育情况。结果表明，转靶基因的愈伤组织后期体胚诱导能力没有受到影响图3。观察45d左右的体细胞胚，发现转基因体胚的胚根明显比对照长，在体视显微镜下测量胚根的长度，每个样本三皿重复，每皿随机选取90个单胚。结果表明，转基因体胚的胚根长度比非转基因的长，转LhHB9的体胚胚根长是对照的3倍图4。序列表南京林业大学一种杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9及其应用1009SIPOSequenceListing1.012794DNALiriodendronchinense×tulipifera1cttctgttttggtggttttcttgggttttgaagtgaaattggaggtgggttttgtgattt60ttctagaaagctagcttgttttgggaatttgcttggaacatttggagaaatggcgcttgc120gatgcacaaggattcgtcggcagcagcagcagcagcagcagcagcagctaagcagttgga180tgcaagcaagtatgtgaggtatacgcccgagcaggttgaggcgttggagagggtgtatat240ggagtgcccgaagccgagctcgatgcgtaggcagcagcttataagagaatgccctatact300gtcgaatatcgagccgaagcagatcaaggtctggtttcagaatcgaagatgccgcgagaa360gcagaggaaagaagcttcacgtctccagacagtaaacaggaagctcactgccatgaacaa420gctgttgatggaggagaacgaccgcctacagaagcaggtctcgcagctggtgtatgagaa480tggatacatgcggcagcaactgcagaatgcatctgtggcgaccacggacacaagctgcga540gtccgtggtcactagcggtcagcaccaacaaaacccaacaccacagcatccgcaaaggga600tgctaacaacccagctgggctccttgcgattgcagaggagaccctggcagagttcctctc660caaggctactggaactgctgtcgactgggtccagatgcttgggatgaagcctggtccgga720ttctattggaatcgttgctgtttcccacaactgtagtggggttgcagcacgagcctgcgg780tcttgtgagtttagaacccacaaaggtcgcagaaatcctcaaagatcgtccatcgtggtt840ccgtgattgccgttgcctcgagatagttactgtgctccctgctgggaatggagggactat900cgagcttatttacatgcagacatatgcacctactacattggcatctgcacgcgacttttg960gacgctgagatacaccacgggtttagaagatggcagtcttgtgatctgtgagaggtcact1020gactccatcaactggtggcccagctggcccgcctgctccaaactttgtacgagctgaaat1080gctccccagtggttatctgatccgcccatgtgagggtggtggctcgatcattcacatcgt1140tgatcacgtcgatttagatgcatggagtgtccccgaggtgctccgcccactctatgaatc1200gtcgaagatactggcacagaaaatgacaattgcggcattgcgccacataaggcaaattgc1260tcaagagaccagcggggaaattgtatatggtgggggccgtcagcctgcagtgctacgaac1320atttagtcagagattaagcaggggtttcaatgatgctgtaaatggttttgcggatgatgg1380gtggtcgttgatgggcaatgatggtatggaggatgtcactatcgccattaactccacgcc1440aaacaagctttttggttctcatgttaactcaacaatgctccctacaatgggaggtggcgt1500gctatgtgcaaaggcatccatgctgctccagaatgtgccacctgctttgcttgtccgctt1560tctgagggagcaccgttctgagtggtccgactgtggcattgatgcttattctgctgcctc1620gctgaaggccagtccttatgcggtccctggtgcaagagcaggtggcttccccggcagtca1680ggtcattttacctcttgctcataccgttgaacacgaagagatgttggaggttatcaggct1740tgaaggccatgggttcgcccaagatgatgctattttatcaagagacatgtacttgttaca1800gctatgcagtggaattgatgaaaatgcagcaggtgcatgtgcccagcttgtctttgcgcc1860gattgatgaatacttcgccgatgattccccactactgccgtcgggtttccgtgtcatacc1920attagacccaaaaacagatgggccggcggcgactcgaacactcgaccttgcatctgcgct1980tgaaggaccaggtggggcacgcccagttggtgaagccacgacaaacgcatataatttaag2040atctgtgctgacaattgcattccagtttacatatgagaaccacctccgtgacaatgtggc2100ggcgatggcccgccagtatgttcgaagcgttgtggggtcggtacagagggtggcaatggc2160aatcgcaccttcacgacttggctcacatgtggggccaaagccgccacctgggacccctga2220ggccctcaccctggcgcggtggatttgccggagctacaggttccatactggagtggagct2280cctcagggctgactctcaagaaggcgattctgttttgaaactgctgtggcaccattctga2340tgctatcatgtgctgttcattgaaatctaatgcatcaccggtcttcacctttgcgaacca2400agcgggccttgacatgttggaaaccacactcattgctctacaggatatcatgcttgacaa2460gattctcgatgagggcggccggaaggttttgtgttcagagtttgccaagattatgcaaca2520gggttttgcttatctgccatctggagtgtgcgtctcgagcatgggcagaccagtgtcgta2580tgagcaagcaattgcatggaaggtcctgaatgaagaggactcaaatcactgcttggcctt2640cttgttcatgaactggtcttttctttgaacccatatatattatatagatttccctagttt2700ggcttgagaaaactttcttaaactctcctctgcccttctcttattatatatataatgctt2760aagttatgaaagatagccaatgtaggtagaggac27942852PRTLiriodendronchinense×tulipifera2MetAlaLeuAlaMetHisLysAspSerSerAlaAlaAlaAlaAlaAla151015AlaAlaAlaAlaLysGlnLeuAspAlaSerLysTyrValArgTyrThr202530ProGluGlnValGluAlaLeuGluArgValTyrMetGluCysProLys354045ProSerSerMetArgArgGlnGlnLeuIleArgGluCysProIleLeu505560SerAsnIleGluProLysGlnIleLysValTrpPheGlnAsnArgArg65707580CysArgGluLysGlnArgLysGluAlaSerArgLeuGlnThrValAsn859095ArgLysLeuThrAlaMetAsnLysLeuLeuMetGluGluAsnAspArg100105110LeuGlnLysGlnValSerGlnLeuValTyrGluAsnGlyTyrMetArg115120125GlnGlnLeuGlnAsnAlaSerValAlaThrThrAspThrSerCysGlu130135140SerValValThrSerGlyGlnHisGlnGlnAsnProThrProGlnHis145150155160ProGlnArgAspAlaAsnAsnProAlaGlyLeuLeuAlaIleAlaGlu165170175GluThrLeuAlaGluPheLeuSerLysAlaThrGlyThrAlaValAsp180185190TrpValGlnMetLeuGlyMetLysProGlyProAspSerIleGlyIle195200205ValAlaValSerHisAsnCysSerGlyValAlaAlaArgAlaCysGly210215220LeuValSerLeuGluProThrLysValAlaGluIleLeuLysAspArg225230235240ProSerTrpPheArgAspCysArgCysLeuGluIleValThrValLeu245250255ProAlaGlyAsnGlyGlyThrIleGluLeuIleTyrMetGlnThrTyr260265270AlaProThrThrLeuAlaSerAlaArgAspPheTrpThrLeuArgTyr275280285ThrThrGlyLeuGluAspGlySerLeuValIleCysGluArgSerLeu290295300ThrProSerThrGlyGlyProAlaGlyProProAlaProAsnPheVal305310315320ArgAlaGluMetLeuProSerGlyTyrLeuIleArgProCysGluGly325330335GlyGlySerIleIleHisIleValAspHisValAspLeuAspAlaTrp340345350SerValProGluValLeuArgProLeuTyrGluSerSerLysIleLeu355360365AlaGlnLysMetThrIleAlaAlaLeuArgHisIleArgGlnIleAla370375380GlnGluThrSerGlyGluIleValTyrGlyGlyGlyArgGlnProAla385390395400ValLeuArgThrPheSerGlnArgLeuSerArgGlyPheAsnAspAla405410415ValAsnGlyPheAlaAspAspGlyTrpSerLeuMetGlyAsnAspGly420425430MetGluAspValThrIleAlaIleAsnSerThrProAsnLysLeuPhe435440445GlySerHisValAsnSerThrMetLeuProThrMetGlyGlyGlyVal450455460LeuCysAlaLysAlaSerMetLeuLeuGlnAsnValProProAlaLeu465470475480LeuValArgPheLeuArgGluHisArgSerGluTrpSerAspCysGly485490495IleAspAlaTyrSerAlaAlaSerLeuLysAlaSerProTyrAlaVal500505510ProGlyAlaArgAlaGlyGlyPheProGlySerGlnValIleLeuPro515520525LeuAlaHisThrValGluHisGluGluMetLeuGluValIleArgLeu530535540GluGlyHisGlyPheAlaGlnAspAspAlaIleLeuSerArgAspMet545550555560TyrLeuLeuGlnLeuCysSerGlyIleAspGluAsnAlaAlaGlyAla565570575CysAlaGlnLeuValPheAlaProIleAspGluTyrPheAlaAspAsp580585590SerProLeuLeuProSerGlyPheArgValIleProLeuAspProLys595600605ThrAspGlyProAlaAlaThrArgThrLeuAspLeuAlaSerAlaLeu610615620GluGlyProGlyGlyAlaArgProValGlyGluAlaThrThrAsnAla625630635640TyrAsnLeuArgSerValLeuThrIleAlaPheGlnPheThrTyrGlu645650655AsnHisLeuArgAspAsnValAlaAlaMetAlaArgGlnTyrValArg660665670SerValValGlySerValGlnArgValAlaMetAlaIleAlaProSer675680685ArgLeuGlySerHisValGlyProLysProProProGlyThrProGlu690695700AlaLeuThrLeuAlaArgTrpIleCysArgSerTyrArgPheHisThr705710715720GlyValGluLeuLeuArgAlaAspSerGlnGluGlyAspSerValLeu725730735LysLeuLeuTrpHisHisSerAspAlaIleMetCysCysSerLeuLys740745750SerAsnAlaSerProValPheThrPheAlaAsnGlnAlaGlyLeuAsp755760765MetLeuGluThrThrLeuIleAlaLeuGlnAspIleMetLeuAspLys770775780IleLeuAspGluGlyGlyArgLysValLeuCysSerGluPheAlaLys785790795800IleMetGlnGlnGlyPheAlaTyrLeuProSerGlyValCysValSer805810815SerMetGlyArgProValSerTyrGluGlnAlaIleAlaTrpLysVal820825830LeuAsnGluGluAspSerAsnHisCysLeuAlaPheLeuPheMetAsn835840845TrpSerPheLeu850325DNALhHB9-F引物序列Artificial3cttctgttttggtggttttcttggg25425DNALhHB9-R引物序列Artificial4gtcctctacctacattggctatctt25538DNAPJIT166-LhHB9F引物序列Artificial5ggagaggacagcccaagcttatggcgcttgcgatgcac38651DNAPJIT166-LhHB9R引物序列Artificial6gctcaccatggatcctctagaaagaaaagaccagttcatgaacaagaaggc51748DNAPBI121-LhHB9-F引物序列Artificial7ggagagaacacgggggactctagaggatccatggcgcttgcgatgcac48858DNAPBI121-LhHB9-R引物序列Artificial8ttgaacgatcggggaaattcgagctctcaaagaaaagaccagttcatgaacaagaagg58924DNA35S-F序列Artificial9tgaagatagtggaaaaggaaggtg24

权利要求：1.杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.含有权利要求1所述的杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9的表达载体、宿主菌。4.权利要求1所述的杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9在体胚发生中的应用。5.权利要求1所述的杂交鹅掌楸体胚胚根伸长关键基因LhHB9的在促进体胚胚根伸长中的应用。

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