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申请/专利权人：青海省农林科学院

摘要：本发明属于油菜育种技术领域，公开了一种甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物及方法，序列为：SEQIDNO：1‑SEQIDNO：22。本发明筛选的分子标记是不育系Bnmfs的不育基因两侧紧密连锁的标记，缩小了不育基因在甘蓝型油菜染色体的区间，为后续该基因的克隆奠定基础；筛选的分子标记，特异性强、稳定性高，并且标记的筛选方法操作简单；筛选了共显性标记，能鉴别分离群体中显性纯合、杂合和隐性纯合单株，可以克服传统育种依靠表型进行选择的特点，减少育种工作量，缩短育种年限，加快育种进程。

主权项：1.一种甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法，其特征在于，甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法使用的甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的引物的序列为：SEQIDNO：1-SEQIDNO：22；所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法包括以下步骤：步骤一，不育系Bnmfs的不育基因定位群体构建：由于雌雄不育材料，利用杂合可育单株连续套袋自交获得F7-F9群体进行定位；步骤二，已公布的标记对不育系Bnmfs的不育基因进行初步定位：筛选与不育系Bnmfs的不育基因连锁的分子标记，进行初步定位，定位在染色体上；已公布的标记是指AFLP标记和已知引物序列的SSR标记；步骤三，开发新的分子标记：根据不育系Bnmfs的不育基因所在染色体的区间序列用SSRHunter1.3软件检测SSR位点，并使用Primer5软件设计SSR引物；InDel标记是根据重测序在该区间的SNP设计；步骤四，缩小不育系Bnmfs的不育基因在染色体的区间：用新的SSR标记和InDel标记对不育系Bnmfs的不育基因进行定位，缩小不育基因在染色体上的区间；步骤五，共显性标记筛选：对新的分子标记在F8-F9群体中进行共显性标记筛选。

全文数据：甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物及方法技术领域[0001]本发明属于油菜育种技术领域，尤其涉及一种甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物及方法。背景技术[0002]在甘白种间杂交后代中，首次发现雌雄同时败育的性状，由一对隐性基因控制，该不育系定名为Bnmfs，并且进行基因定位。2009年，四川农业大学李平课题组发现了一份雌雄不育的水稻突变体MFS-Z9，并且定位到水稻第2号染色体上，其它作物中，如：小麦、大豆等作物中发现了雌雄不育的植株，但是主要集中在细胞学研究上。根据目前研究，甘蓝型油菜雌雄不育基因无连锁的标记，其它作物的标记也无法应用到该材料中。利用1536对AFLPsEcoRIMsel，PstlMsel，ScalMsel标记和917对SSR标记（来源于http:www.brassica.inforesourcemarkersssr-exchange.php,http:brassicadb.orgbradgeneticMarker.php在2:2不育：可育）混池各取10株的F2衍生群体近等基因系）中筛选，得到7对AFLP标记和1对SSR标记有多态性。在614株单株中也能找到多态性。7对AFLP标记测序后Blast分析，其中4对无法与甘蓝型油菜基因组比对，2对比对到甘蓝型油菜C9染色体上，1对比对到甘蓝型油菜C4染色体上；1对SSR标记比对到甘蓝型油菜C3染色体上。[0003]从上面结论看出，传统的方法无法快速定位，利用重测序技术对雌雄不育植株和纯合可育植株进行BSA集团分离分析法测序，各取20个单株，得到三个差异区间，都在甘蓝型油菜C3染色体上。根据重测序结果获得的三个差异区间的SNP设计InDel标记以及1对SSR引物2Mb范围内设计SSR引物共220对，获得11对多态性标记（InDel标记6对，SSR标记5对），其中重测序的两个区间没有多态性标记，排除这两个区间，限定在I.IlMb45.34-46.45Mb的区间内。[0004]现有技术存在的问题及解决方法：由于得到雌雄不育突变体为隐性突变，而且雌雄都不育，所以只有杂合单株通过自交，才能分离出不育单株，另外，筛选得到的多态性标记在955株不育单株中验证，有较高的交换率，这可能与F2衍生群体有较大的遗传背景噪音引起的。通过基因组重测序和转录组测序以及结合传统的标记分析，能够确定雌雄不育候选基因。发明内容[0005]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物及方法。[0006]雌雄不育的甘蓝型油菜在油菜中未见报道，对雌雄不育的基因可能为未知基因或者是一个新功能的基因。通过分子标记筛选结合基因组重测序技术确定候选区间，结合候选区间的基因功能确定雌雄不育的候选基因。本发明是这样实现的，利用1536对AFLPsEcoRIMsel，PstlMsel，ScalMsel标记和917对SSR标记（来源于http:www.brassica.inforesourcemarkersssr-exchange.php,http:brassicadb.orgbradgeneticMarker.php在2:2不育：可育）混池各取10株的F2衍生群体近等基因系）中筛选，得到7对AFLP标记和1对SSR标记有多态性。在614株单株中也能找到多态性。7对AFLP标记测序后Blast分析，其中4对无法与甘蓝型油菜基因组比对，2对比对到甘蓝型油菜C9染色体上，1对比对到甘蓝型油菜C4染色体上；1对SSR标记比对到甘蓝型油菜C3染色体上。[0007]从上面结论看出，传统的方法无法快速定位，利用重测序技术对雌雄不育植株和纯合可育植株进行BSA集团分离分析法测序，各取20个单株，得到三个差异区间，都在甘蓝型油菜C3染色体上。根据重测序结果获得的三个差异区间的SNP设计InDel标记以及1对SSR引物2Mb范围内设计SSR引物共220对，获得11对多态性标记（InDel标记6对，SSR标记5对），其中重测序的两个区间没有多态性标记，排除这两个区间，限定在I.IlMb45.34-46.45Mb的区间内。一种甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物，所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选所用引物的序列为:SEQIDN0:1-SEQIDN0:22。[0008]本发明的另一目的在于提供一种利用所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的方法，所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法包括以下步骤：[0009]步骤一，不育系Bnmfs的不育基因定位群体构建：由于雌雄不育材料，利用杂合可育单株连续套袋自交获得F7-F9群体进行定位；[0010]步骤二，已公布的标记对不育系Bnmfs的不育基因进行初步定位：筛选与不育系Bnmfs的不育基因连锁的分子标记，进行初步定位，定位在染色体上；已公布的标记是指AFLP标记和已知引物序列的SSR标记；[0011]步骤三，开发新的分子标记:根据不育系BnmfS的不育基因所在染色体的区间序列用SSRHunter1.3软件检测SSR位点，并使用Primer5软件设计SSR引物；InDel标记是根据重测序在该区间的SNP设计；[0012]步骤四，缩小不育系BnmfS的不育基因在染色体的区间：用新的SSR标记和InDe1标记对不育系Bnmfs的不育基因进行定位，缩小不育基因在染色体上的区间；[0013]步骤五，共显性标记筛选:对新的分子标记在F8-F9群体中进行共显性标记筛选。[0014]本发明的另一目的在于提供一种使用所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物鉴定甘蓝型油菜可育株的纯合和杂合。[0015]本发明通过已经筛选得到的一对SSR标记以及基因组重测序获得的三个区间（C3:35·40-35·68Mb、35·74-35·75Mb、45·34-46·45Mb的SNP，设计220对InDel和SSR引物，获得11对有多态性的引物。12对引物条带清楚，并且除了InDel45标记外，都是共显性标记，并在955株不育单株中得到验证。这些标记与不育系Bnmfs的不育基因紧密连锁。[0016]本发明筛选的分子标记是不育系Bnmfs的不育基因两侧紧密连锁的标记，缩小了不育基因在甘蓝型油菜染色体的区间，为后续该基因的克隆奠定基础;筛选的分子标记，特异性强、稳定性高，并且标记的筛选方法操作简单;筛选了共显性标记，能鉴别分离群体中显性纯合、杂合和隐性纯合单株，可以克服传统育种依靠表型进行选择的特点，减少育种工作量，缩短育种年限，加快育种进程。[0017]表1多态性标记的位置附图说明[0019]图1是本发明实施例提供的甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法流程图。[0020]图2是本发明实施例提供的重测序差异区间示意图。[0021]图3是本发明实施例提供的标记连锁示意图。[0022]图4是本发明实施例提供的SSR19标记共显不意图。具体实施方式[0023]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0024]本发明通过发掘新的分子标记，构建遗传连锁图，确定不育系Bnmfs的不育基因在染色体上的位置，为后续候选基因选择以及该基因在育种上应用提供理论支撑。[0025]下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。[0026]本发明实施例提供的甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的引物的序列为：[0027]SSRlO：[0028]SEQIDN0:1正向引物:GCCAACTTTCCCTTTCCA[0029]SEQID从：2反向引物：1'170：1'：11^^1；7^0^6[0030]SSR14[0031]SEQID恥：3正向引物：6厶1'1761'170：1'1'1'：1'1'11^[0032]SEQID从：4反向引物：〇八丁八〇0：1'1'11^：11'0^[0033]SSR18[0034]SEQID恥：5正向引物:66八1'1^^〇6八八〇0^1'11'[0035]SEQID[0036]SSR19[0037]SEQID恥：7正向引物:60^厶〇厶7^1'1'：11^61^6[0038]SEQID[0039]SSR89[0040]SEQID[0041]SEQID恥：⑺反向引物：⑺^八⑺八⑺八^!'!'!'^^!：[0042]InDe136[0043]SEQID恥：11正向引物：：7^丁66〇八八1'1'1'11^八八6〇[0044]SEQID从：12反向引物：1'1'：7^厶6660^^丁611^丁[0045]InDe138[0046]SEQID[0047]SEQID从：14反向引物：1'1'0^661'：1'：11^^6：1^[0048]InDe139[0049]SEQIDNO:15正向引物：CTCCCTGATGGAAATAAATGSEQIDNO:16反向引物：GAAGGTGTGTTCCTTACCAAInDel44[0050]SEQID[0051]SEQID从：18反向引物：厶丁6^61'0^61'11^厶厶60：[0052]InDe145[0053]SEQID[0054]SEQID[0055]InDe162[0056]SEQID从：21正向引物：〇厶1'7^厶61'1761'1'11^611^[0057]SEQID[0058]如图I所示，本发明实施例提供的甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法包括以下步骤：[0059]S101:不育系Bnmfs的不育基因定位群体构建：由于雌雄不育材料，利用杂合可育单株连续套袋自交获得F7-F9群体进行定位；[0060]S102:已公布的标记对不育系BnmfS的不育基因进行初步定位：筛选与不育系Bnmfs的不育基因连锁的分子标记，进行初步定位，定位在染色体上；已公布的标记是指AFLP标记EcoRIMseI，PstIMseI，ScaIMseI和已知引物序列的SSR标记；[0061]S103:开发新的分子标记:根据不育系Bnmfs的不育基因所在染色体的区间序列用SSRHunter1.3软件检测SSR位点，并使用Primer5软件设计SSR引物；InDel标记是根据重测序在该区间的SNP设计；[0062]S104:缩小不育系Bnmfs的不育基因在染色体的区间：用新的SSR标记和InDel标记对不育系Bnmfs的不育基因进行定位，缩小不育基因在染色体上的区间；[0063]S105:共显性标记筛选:对新的分子标记在F8-F9群体中进行共显性标记筛选。[0064]下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。[0065]本发明实施例提供的甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法包括以下步骤：[0066]1不育系Bnmfs的不育基因定位群体构建：以甘蓝型油菜青油14号与甘蓝型油菜青油14号和白菜型油菜大黄油菜杂交后代杂交，获得雌雄不育突变体，调查F2发现一对隐性基因控制，然后可育单株分别套袋，获得自交种，每年都从分离群体中可育单株套袋选择，构建了F7-F9群体；[0067]2用已公布的标记对不育系Bnmfs的不育基因进行定位：用AFLP标记（EcoRIMseI，PstIMseI，ScaIMseI和已知引物序列的SSR标记对F7群体的614个单株对不育系Bnmfs的不育基因进行定位。找到了8个已公布的标记F01-F07的AFLP标记、Nal0-G06的SSR标记与不育系Bnmfs的不育基因连锁，并对这些标记的特异片段在BRAD数据库进行序列比对，结合重测序结果，发现雌雄不育系Bnmfs的不育基因位于甘蓝型油菜染色体C03上。[0068]3开发新的分子标记:AFLP转化成SCAR标记未能成功，从BRAD数据库下载NalO-G06标记两侧2M区域的序列，用SSRHunter1.3软件检测这个区间的SSR位点，并使用Primer5软件设计SSR引物，共设计62对引物，得到5对多态性引物，根据重测序结果，在选定区间内设计InDel标记，共得到6对多态性标记。[0069]⑷新开发标记的验证:用新设计的11对SSR和InDel标记在798不育单株的F8-F9群体对不育系Bnmfs的不育单株进行验证，结果都与F7群体不育片段扩增的大小一致。[0070]5共显性标记筛选:对11对SSR标记在F7-F9群体中进行共显性标记筛选，除InDel45不是共显性标记，其余都是共显标记。[0071]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物，其特征在于，所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的引物的序列为:SEQIDN0:1-SEQIDN0:22。2.—种利用如权利要求1所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物及方法，其特征在于，所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法包括以下步骤：步骤一，不育系Bnmfs的不育基因定位群体构建：由于雌雄不育材料，利用杂合可育单株连续套袋自交获得F7-F9群体进行定位；步骤二，已公布的标记对不育系Bnmfs的不育基因进行初步定位：筛选与不育系Bnmfs的不育基因连锁的分子标记，进行初步定位，定位在染色体上；已公布的标记是指AFLP标记和已知引物序列的SSR标记；步骤三，开发新的分子标记：根据不育系Bnmfs的不育基因所在染色体的区间序列用SSRHunter1.3软件检测SSR位点，并使用Primer5软件设计SSR引物；InDel标记是根据重测序在该区间的SNP设计；步骤四，缩小不育系Bnmfs的不育基因在染色体的区间：用新的SSR标记和InDe1标记对不育系Bnmfs的不育基因进行定位，缩小不育基因在染色体上的区间；步骤五，共显性标记筛选:对新的分子标记在F8-F9群体中进行共显性标记筛选。3.如权利要求2所述的甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法，其特征在于，所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法包括以下步骤:利用重测序技术对雌雄不育植株和纯合可育植株进行BSA测序，各取20个单株，得到三个差异区间，都在甘蓝型油菜C3染色体上;根据重测序结果获得的三个差异区间的SNP设计InDel标记以及1对SSR引物2Mb范围内设计SSR引物共220对，获得11对多态性标记，InDel标记6对，SSR标记5对，重测序的两个区间没有多态性标记，排除该两区间，限定在1.11Mb的区间内。4.一种使用权利要求1所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物鉴定甘蓝型油菜可育株的纯合和杂合。

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