申请/专利权人：苏州恩可医药科技有限公司

申请日：2019-03-05

公开（公告）日：2022-10-11

公开（公告）号：CN109852727B

主分类号：C12Q1/70

分类号：C12Q1/70;C12Q1/6851

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.10.11#授权;2019.07.02#实质审查的生效;2019.06.07#公开

摘要：本发明提出一个全新的HBV‑cccDNA检测的策略，通过设计与HBV‑DNA序列中DR2区域下游配对的启动引物对HBV‑cccDNA正链进行基于通用碱基的插入替换的单链DNA扩增，得到含有通用碱基的新生的单链DNA，并依此设计与HBV‑DNA的DR2区域上游配对的选择引物，可以特异性结合该含有通用碱基的新生的单链DNA，且无法与HVB‑cccDNA负链结合，也无法与HBV‑rcDNA的任一条链结合，从而仅对HBV‑cccDNA的正链进行选择性扩增，而不扩增HBV‑rcDNA，实现了在对HBV‑cccDNA的特异性检测中避免了HBV‑rcDNA的干扰。

主权项：1.一种非诊断目的的基于通用碱基插入替换的HBV-cccDNA特异性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：设计启动引物：所述启动引物与cccDNA正链配对，所述与cccDNA正链配对的序列位于HBV-DNA序列中DR2区域的下游；第1步PCR反应：加入所述启动引物，以cccDNA正链为模板，开始单向PCR反应，得到新生的单链DNA分子；所述新生的单链DNA分子中常用碱基A、T、G、C中的一种被替换为通用碱基；所述的通用碱基是可以与至少两种常用碱基进行互补配对的碱基；所述第1步PCR反应在rcDNA中缺乏完整的正链DNA模板，无法开始扩增；设计选择引物：所述选择引物与新生的单链DNA分子的3’端配对，其对应的序列位于HBV-DNA序列中DR2区域上游；第2步PCR反应：加入所述选择引物，对第1步PCR反应中所述新生的单链DNA分子进行选择性扩增，得到选择性扩增的产物；所述的选择引物能够与新生的单链DNA分子配对，但是不能与cccDNA的互补序列配对；定性或定量检测第2步PCR反应中所述的选择性扩增的产物。

全文数据：基于通用碱基替换插入的HBV-cccDNA检测方法与试剂盒技术领域本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种基于通用碱基替换插入的HBV-cccDNA检测方法与试剂盒。背景技术常规PCR扩增技术是在反应体系中同时加入正向引物和反向引物图1A，它们分别与目标序列双链DNA分子的反义链和正义链的3’端区域配对，开始延长反应，经过多轮循环对模板进行指数扩增，最终获得大量的与目标序列相同的双链DNA产物。这种扩增技术在反应体系中只有目标序列的单链DNA正义链或是只有与目标序列互补的单链DNA反义链存在时也可以扩增，最终无差别地获得大量与目标序列相同的双链DNA产物。例如，在图1B中以单链的正义链DNA为模板的PCR反应中，反向引物与之配对开始延长，形成反义链DNA；之后，正向引物可以与新生的反义链DNA配对；最终，正向引物和反向引物共同对双链DNA模板进行指数扩增，获得大量的与目标序列相同的双链DNA产物。图1C中以单链的反义链DNA为模板的PCR反应也是如此。这种无差别扩增的结果在对有特殊结构的DNA分子例如乙型病毒性肝炎病毒HBV的松弛环状的双链DNA，relaxedcircularDNA，rcDNA进行PCR时也一样能被观察到图2。乙肝病毒HBV为嗜肝DNA病毒，是引起乙型病毒性肝炎以下简称“乙肝”的病原体。其在细胞外的DNA为松弛环状的双链DNArelaxedcircularDNA，rcDNA分子，结构如图2A。rcDNA负链MinusChain的5’端与3’端位于基因组序列DR1区域DirectRepeat，短链顺向复制序列附近，5’端与3’端之间有一个长度为数个碱基的“缺刻”nick；正链Plus-Chain的5’端紧接基因组序列DR2区域，5’端与3’末端有较大的“缺口”gap。在乙肝病毒的复制过程中，HBV病毒DNA进入宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，两条链的缺口均被补齐，而形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA。cccDNA是评价HBV感染状态及药物疗效最重要的指标，对于乙肝的临床诊断、治疗、药物研发等均具有重要意义。在HBV-DNA定量检测中，为了区分rcDNA和cccDNA分子，现有的检测方法使用了跨越缺口和缺刻的2条引物。但是，在反应过程中，这2条引物的延伸产物可以相互配对图2A，形成全长的模板，最终扩增获得与以cccDNA为模板的反应一致的产物图2B。为了排除rcDNA在检测cccDNA中的信号干扰，目前常用的检测方法不得不使用一些DNA酶，如绿豆核酸酶MungBeanNuclease，MBN、不降解质粒的ATP依赖DNA酶Plasmid-SafeATP-dependentDNase，PSAD等来降解样品中的rcDNA。但这些方法均存在着步骤繁琐、处理效率低、耗时长至少4h以上、很难实现准确定量检测、重复性差、假阴性率高等问题。发明内容基于此，有必要提供一种HBV-cccDNA的特异性检测方法，用于乙肝病毒cccDNA的扩增和定量检测，并且同时排除rcDNA的干扰，并力求操作简便、重复性好、灵敏度和特异性高。为实现上述目的，本发明提供了一种基于通用碱基插入替换的HBV-cccDNA的特异性检测方法，具体技术方案如下：一种基于通用碱基插入替换的HBV-cccDNA的特异性检测方法，包括以下步骤：设计启动引物：所述启动引物与cccDNA正链配对，所述与cccDNA正链配对的序列位于HBV-DNA序列中DR2区域的下游；第1步PCR反应：加入所述启动引物，以cccDNA正链为模板，开始单向PCR反应，得到新生的单链DNA分子；所述新生的单链DNA分子中常用碱基A、T、G、C中的一种被替换为通用碱基；所述的通用碱基是可以与至少两种常用碱基进行互补配对的碱基；设计选择引物：所述选择引物与新生的单链DNA分子的3’端配对，其对应的序列位于HBV-DNA序列中DR2区域上游；第2步PCR反应：加入所述选择引物，对第1步PCR反应中所述新生的单链DNA分子进行选择性扩增，得到选择性扩增的产物；所述的选择引物能够与新生的单链DNA分子配对，但是不能与cccDNA的互补序列配对；定性或定量检测第2步PCR反应中所述的选择性扩增的产物。本发明的另一目的是提供一种HBV-cccDNA的特异性检测试剂盒，具体技术方案如下：一种HBV-cccDNA的特异性检测试剂盒，包含有：引物、dATP、dTTP、dGTP、dCTP、通用碱基脱氧核苷三磷酸；所述引物包括：如上所述的启动引物和选择引物。基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：本发明是发明人经过大量创造性劳动提出的一个全新的HBV-cccDNA检测的策略，通过设计与HBV-DNA序列中DR2区域下游配对的启动引物对HBV-cccDNA正链进行基于通用碱基的插入替换的单链DNA扩增，得到含有通用碱基的新生的单链DNA，并依此设计与HBV-DNA的DR2区域上游配对的选择引物，可以特异性结合该含有通用碱基的新生的单链DNA，且无法与HVB-cccDNA负链结合，也无法与HBV-rcDNA的任一条链结合，从而仅对HBV-cccDNA的正链进行选择性扩增，而不扩增HBV-rcDNA，实现了在对HBV-cccDNA的特异性检测中避免了HBV-rcDNA的干扰。并且，本发明所述的PCR扩增方法是“一锅”one-pot反应，即，在反应设置中，只向反应体系中添加成分，而没有分离纯化等步骤。这样保证了目标DNA样品的利用率，在检测应用中可以提高重复性，且操作简单。附图说明图1为常规PCR方法的示意图；图2为常规PCR对HBV-rcDNA和cccDNA的扩增；图3为基于通用碱基的替换插入的HBV-cccDNA特异性扩增方法的原理；图4为实施例1中应用的DNA序列和PCR扩增原理；图5为实施例1中基于I插入的针对双链DNA中一条单链DNA的特异性扩增的检测电泳图；图6为实施例2中基于I插入的单链DNA扩增的检测电泳图；图7为实施例3中Q-PCR检测双链DNA的扩增荧光信号曲线；图8为实施例3中荧光定量PCR中梯度稀释样品的拷贝数对数与对应的Ct值进行拟合分析的结果图；图9为实施例6中在有HBV-rcDNA存在的血清DNA样品中特异性检测目标DNA的电泳结果图；图10为实施例7中在有HBV-rcDNA存在的血清DNA样品中特异性定量检测目标DNA的Q-PCR荧光信号曲线；图11为实施例7中荧光定量PCR中梯度稀释样品的拷贝数对数与对应的Ct值进行拟合分析的结果图。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。反应原理本发明提供了一种基于通用碱基插入替换的HBV-cccDNA的特异性检测方法，包括以下步骤图3A：设计启动引物：所述启动引物与cccDNA正链配对，所述与cccDNA正链配对的序列位于HBV-DNA序列中DR2区域的下游；第1步PCR反应：加入所述启动引物，以cccDNA正链为模板，开始单向PCR反应，得到新生的单链DNA分子；所述新生的单链DNA分子中常用碱基A、T、G、C中的一种被替换为通用碱基；所述的通用碱基是可以与至少两种常用碱基进行互补配对的碱基；设计选择引物：所述选择引物与新生的单链DNA分子的3’端配对，其对应的序列位于HBV-DNA序列中DR2区域上游；第2步PCR反应：加入所述选择引物，对第1步PCR反应中所述新生的单链DNA分子进行选择性扩增，得到选择性扩增的产物；所述的选择引物能够与新生的单链DNA分子配对，但是不能与cccDNA的互补序列配对；定性或定量检测第2步PCR反应中所述的选择性扩增的产物。具体地，如图3A所示启动引物与cccDNA正链配对，其序列位于HBV-DNA序列中DR2区域的下游；所述选择引物与新生的单链DNA分子的3’端配对，其对应的序列位于DR2区域上游；整个选择性扩增产物所对应的序列跨越DR2区域；整个选择性扩增产物所对应的序列在cccDNA正链中是完整连续的。而这段序列在HBV-rcDNA中正链中是残缺的图3B。因此，在第1步单向PCR反应中，启动引物缺乏完整的正链DNA模板，无法开始扩增；第2步选择性PCR反应中，选择引物不能与HBV-rcDNA的负链配对，无法开始扩增。从而避免rcDNA的信号干扰。具体地，本发明在第1步单向PCR反应体系中，加入启动引物，以目标单链DNA即cccDNA的正链为模板进行单向PCR延长；反应体系中不加入全部4种常用dNTP反应原料dATP、dTTP、dGTP和dCTP，而是加入其中的3种，并以通用碱基脱氧核苷三磷酸替代未加入的一种。通过这种方法，因缺少一种dNTP原料，DNA聚合酶在遇到模板上的与之对应互补的碱基时，只能通过插入通用碱基与之配对，从而在新合成的DNA链上替换插入了通用碱基。再加入选择引物开始第2步选择性PCR反应。在这一步反应中，选择引物只能与新合成的含有通用碱基的DNA序列互补配对，无法与原有的cccDNA中的负链进行配对，也无法与rcDNA中的负链配对，从而实现了对cccDNA检测的特异性，避免了rcDNA的干扰。设计启动引物可选地，所述启动引物选自：引物名称核苷酸序列5’→3’SEQIDNO.R1610ggcgttcacggtggtctcc6R1608cgttcacggtggtctccat16R1606ttcacggtggtctccatgc17R1603acggtggtctccatgcgac18R1601ggtggtctccatgcgacgt19R1599tggtctccatgcgacgtgc20R1597gtctccatgcgacgtgcag21R1595ctccatgcgacgtgcagag22R1593ccatgcgacgtgcagaggt23通用碱基替换插入具体地，在第1步单向PCR反应体系中，加入的脱氧核苷三磷酸为dATP、dTTP、dGTP、dCTP中的任意3种，和1种通用碱基脱氧核苷三磷酸；在这一步的PCR延长反应中，DNA聚合酶催化通用碱基插入新生的DNA链，新生的单链DNA分子中常用碱基A、T、G、C中的一种被替换为通用碱基。可选地，所述通用碱基选自：次黄嘌呤Hypoxanthine，其核苷为Inosine、嗅尿嘧啶BrU5-Bromouridine、3-硝基吡咯3-nitropyrrole、5-硝基吲哚5-nitroindole、7-氮杂吲哚7-Azaindole。优选地，通用碱基为次黄嘌呤或嗅尿嘧啶。更优选地，通用碱基为次黄嘌呤。具体地，一些优选方案中，在第1步单向PCR反应体系中，加入dATP、dTTP、dCTP和次黄嘌呤脱氧核苷三磷酸dITP。在之后的新生DNA链的延长过程中，由于体系中不含dGTP，DNA聚合酶在遇到模板上的胞嘧啶C的时候只能插入次黄嘌呤I来与之配对，从而使得通用碱基次黄嘌呤插入新生的DNA链中，新生的单链DNA分子中的碱基G被替换为I。在第2步选择性PCR反应体系中，加入的选择引物是用腺嘌呤A与新生的单链DNA分子中对应位点的I进行配对，可以启动选择性扩增得到产物；选择引物不能与对应位点为胞嘧啶C的目标单链DNA互补序列进行配对。设计选择引物在确定了在以次黄嘌呤I替换鸟嘌呤G与胞嘧啶C配对的情况下，可选地，所述选择引物选自：引物名称核苷酸序列5’→3’SEQIDNO.AF1488gtAtAggggAAgAttggggAtAtaAAgt24AF1538ggAAgaAAaAggggAgAaAAtAtAttta7AF1544gaAAaAggggAgAaAAtAtAtttaAgAggt25AF1486AAgtAtAggggAAgAttggggAtAtaAA26AF1536AAggAAgaAAaAggggAgAaAAtAtAtt27AF1542AAgaAAaAggggAgAaAAtAtAtttaAgAg28AF1538saAAaAggggAgAaAAtAtAttta29AF1530ggAAgaAAaAggggAgAaAA30可选地，所述定性或定量检测的方法包括：电泳法、荧光染料法、荧光探针法、荧光原位杂交法。设计荧光探针在确定了在以次黄嘌呤I替换鸟嘌呤G与胞嘧啶C配对的情况下，可选地，所述荧光探针选自：其中，所述探针标记有荧光基团和淬灭基团。在一个以次黄嘌呤I替换鸟嘌呤G与胞嘧啶C配对的具体实施例中图4，在第1步单向PCR反应体系中加入待检样品质粒双链DNA包含Plus-ChainMinus-Chain、启动引物R1610SEQIDNO.6、Taq酶、dATP、dTTP、dCTP、dITP。经过加热和退火后，启动引物R1610与目标单链DNAPlus-Chain配对。在之后的新生DNA链的延长过程中，由于体系中不含dGTP，DNA聚合酶在遇到模板上的胞嘧啶C的时候只能插入次黄嘌呤I来与之配对。因此，形成了有I插入、且I与模板上C配对的新生的DNA链，即R1-Chain。在反应体系中再加入选择引物AF1538SEQIDNO.7和dNTPdATP、dTTP、dGTP、dCTP，进行第2步选择性PCR反应。在这一步反应中，选择引物AF1538可以与有I插入的DNA链R1-Chain配对，并开始启动DNA链的合成R2-Chain。在有A、T、G、C等常用碱基脱氧核苷三磷酸存在的情况下，DNA聚合酶将优先在I的对侧插入C，也会少量插入A。由此形成的R2-Chain中可能有多种序列。在后续PCR步骤中，启动引物R1610和选择引物AF1538继续扩增目标DNA序列，C在I的对侧插入的优势不断扩大，最终获得R3-ChainR4-ChainSEQIDNO.4SEQIDNO.5为主的PCR产物。此PCR产物的形成可以通过特异性荧光探针P1558SEQIDNO.9或是兼并荧光探针DP15585’-KcKccaKaKKKKcaKacacK，K＝TG，SEQIDNO.35进行荧光定量检测。由于选择引物AF1538SEQIDNO.7不与负链DNAMinus-Chain，即目标单链DNAPlus-Chain的互补链，进行配对，而只能与新生的含有I插入的DNA链R1-Chain配对，保证了检测的特异性。优选地，所述启动引物的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述通用碱基替换插入方式为以次黄嘌呤I替换鸟嘌呤G与胞嘧啶C配对；所述选择引物的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示,所述探针标记有荧光基团和淬灭基团。在本发明的验证试验中，上述各优选项的组合在Q-PCR荧光定量检测中，给出更低且平坦的基线信号、更高的扩增信号、更陡峭的S曲线和最佳的定量扩增Ct值拟合曲线。本发明的一种HBV-cccDNA的特异性检测试剂盒，该试剂盒中包含有：引物、dATP、dTTP、dGTP、dCTP、通用碱基脱氧核苷三磷酸。该试剂盒主要应用于基于通用碱基插入替换的HBV-cccDNA的特异性检测，在检测中可以仅对HBV-cccDNA的正链进行选择性扩增，而不扩增HBV-rcDNA，从而实现在对HBV-cccDNA的特异性检测中避免了HBV-rcDNA的干扰。其中，所述引物包括：如上文所述的启动引物和选择引物。优选地，所述通用碱基脱氧核苷三磷酸中的通用碱基可以选自：次黄嘌呤Hypoxanthine，其核苷为Inosine、嗅尿嘧啶BrU5-Bromouridine、3-硝基吡咯3-nitropyrrole、5-硝基吲哚5-nitroindole、7-氮杂吲哚7-Azaindole。更优选地，通用碱基选自次黄嘌呤和嗅尿嘧啶。最优地，通用碱基为次黄嘌呤。本发明还提供了一种上述方法或试剂盒在检测HBV中的应用，该应用可以特异性地检测HBV-cccDNA，而不受rcDNA的干扰。其中，对本发明中涉及的各名词解释如下：DNA：脱氧核糖核酸，本文中泛指DNA分子。碱基配对：BasePairing，本文中泛指DNA双螺旋结构中处于对位的2个核酸碱基间通过氢键形成的相互关系。这包括经典的Watson-Crick互补配对，也包括不常见的特殊碱基间的配对。引物配对：PrimerParing，本文中泛指DNA分子之间或分子内部基于碱基互补配对的相互作用形成有序的相互关系。这包括互补区域内碱基对全部遵从碱基互补原则的完全配对，也包括互补区域内出现少量非经典的特殊碱基间配对、或是不配对等现象的部分配对。启动引物：在本文中指的是一条或多条与目标单链DNA序列尤其是指HBV-cccDNA正链的3’端区域进行配对的引物。特别用于启动第1步的单向PCR反应，开始单向PCR的5’端向3’端延长，得到新生的单链DNA分子。启动引物可以在第2步选择性PCR反应中与选择引物一起进行指数扩增。单向PCR：指的是一条引物或是多条同一方向的引物与一条单链DNA配对后启动的、只向一个方向延伸的PCR反应。与使用2条对向引物的常规双向PCR反应中的几何级数指数扩增不同，单向PCR的扩增是算数级数的。选择引物：在本文中指的是一条或多条与新生的含有通用碱基的单链DNA分子配对、但不能与目标单链DNA的互补序列配对的引物。特别用于启动第2步选择性PCR反应，选择性地扩增新生的含有通用碱基的单链DNA，得到序列有所改变的产物。兼并荧光探针DegenerateProbe：与兼并引物DegeneratePrimer类似，兼并荧光探针是寡核苷酸序列的混合物，其中一些位置含有许多可能的碱基，给出具有相似序列的寡核苷酸序列群，可以与给定序列中的所有可能的核苷酸组合进行配对。通用碱基universalnucleicacidbase：可以与至少两种常用碱基进行互补配对的碱基，例如次黄嘌呤Hypoxanthine，其核苷为Inosine，可与A、T、G或C中的任一种进行配对，其结合能力为I:CI:AI:GI:T；或是例如嗅尿嘧啶BrU5-Bromouridine，可与A或G进行配对；可选地，本发明中还可选用其它具有能够与至少两种常用碱基互补配对的通用碱基，例如3-硝基吡咯3-nitropyrrole、5-硝基吲哚5-nitroindole、7-氮杂吲哚7-Azaindole等等。PCR反应中，在DNA聚合酶的催化下，这些通用碱基可以插入新生的DNA链。次黄嘌呤脱氧核苷三磷酸，即，脱氧次黄苷三磷酸，脱氧肌苷三磷酸，deoxyinosinetriphosphate，dITP，CAS95648-77-4。溴脱氧尿嘧啶核苷三磷酸，5-Bromo-2’-deoxyuridine5’-triphosphate，BrdUTP，CAS102212-99-7。实施例1基于I插入的针对双链DNA中一条单链DNA的特异性扩增化学合成拼装目标序列pDR2pSEQIDNO.1，用内切酶EcoRISacI处理后插入pUC57质粒中，构建对照质粒。测序确认pDR2p序列是正确的。对照质粒pDR2p的插入序列SEQIDNO.1：5’-gaattcgggacgtcctttgtctacgtcccgtcggcgctgaatcccgcggacgacccgtctcggggccgcttggggctctaccgtccccttctccgtctgccgttccggccgaccacggggcgcacctctctttacgcggtctccccgtctgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcccaccggaacttgcccaaggtctgagctc-3’本实施例以pDR2p正链中的下列区域作为检测目标。目标单链DNASEQIDNO.2：5’-ggccgaccacggggcgcacctctctttacgcggtctccccgtctgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcc-3’单链DNA扩增实验设计：1对照质粒与启动引物R1610SEQIDNO.6、Taq酶、dATP、dTTP、dCTP、dITP混合，进行第1步单向PCR反应。2在上述反应体系中，继续加入选择引物AF1538SEQIDNO.7和dNTPdATP、dTTP、dGTP、dCTP，进行第2步选择性PCR反应。上述步骤的反应示意图如图4。同时，设置阳性对照实验和阴性对照实验。其中阳性对照使用扩增实验中的启动引物R1610SEQIDNO.6和与对照质粒中目标序列完全配对的引物F1538SEQIDNO.8，而阴性对照使用扩增实验中的启动引物R1610SEQIDNO.6和选择引物AF1538SEQIDNO.7。阳性对照和阴性对照的反应体系中加入常规的dATP、dTTP、dGTP、dCTP混合液，而不是dATP、dTTP、dCTP、dITP混合液。引物序列如下：启动引物R1610SEQIDNO.6：5’-ggcgttcacggtggtctcc-3’选择引物AF1538SEQIDNO.7：5’-ggAAgaAAaAggggAgAaAAtAtAttta-3’引物F1538SEQIDNO.8：5’-acggggcgcacctctcttta-3’置于PCR仪中反应，程序设置为：第1步单向PCR反应：95℃120sec；16cycles×95℃15sec，55℃30sec，72℃30sec；第2步选择性PCR反应：95℃120sec；10cycles×95℃15sec，45℃30sec，72℃30sec；30cycles×95℃15sec，55℃30sec，72℃30sec。将PCR产物进行电泳检测，结果如图5，其中M为分子量Marker。阳性对照Lane1给出明显条带，说明启动引物R1610SEQIDNO.6和与对照质粒中目标序列完全配对的引物F1538SEQIDNO.8可以扩增目标序列以及其互补序列。而阴性对照Lane2在同样条件下没有条带，说明启动引物R1610和选择引物AF1538不能扩增目标序列以及其互补序列，这是因为选择引物AF1538不能与目标序列的互补链Minus-Chain配对。单链DNA扩增实验Lane3给出清晰条带，说明只有在有I插入、且形成了I与模板上的C配对的新生DNA链图4中的R1-Chain后，选择引物AF1538和启动引物R1610才能开始进行指数扩增。将单链DNA扩增实验的最终扩增产物进行测序，确认了PCR产物的序列为R3-ChainR4-ChainSEQIDNO.4SEQIDNO.5。R3-Chain序列SEQIDNO.4：5’-ggAAgaAAaAggggAgAaAAtAtAtttacgcggtctccccgtctgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcc-3’R4-Chain序列SEQIDNO.5：5’-ggcgttcacggtggtctccatgcgacgtgcagaggtgaagcgaagtgcacacggtccggcagatgagaaggcacagacggggagaccgcgtaaaTaTaTTtTcTccccTtTTtcTTcc-3’本实施例证明了本发明所述的单链DNA扩增的方法可以实现，也证明了选择引物无法与目标单链DNA互补序列配对，保证了扩增的特异性。实施例2基于I插入的单链DNA特异性扩增化学合成ChPSEQIDNO.2和ChMSEQIDNO.3单链DNA，脱盐纯化后作为单链DNA待检物。ChP序列：目标DNA单链SEQIDNO.2：5’-ggccgaccacggggcgcacctctctttacgcggtctccccgtctgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcc-3’ChM序列：目标DNA单链ChP序列的互补序列SEQIDNO.3：5’-ggcgttcacggtggtctccatgcgacgtgcagaggtgaagcgaagtgcacacggtccggcagatgagaaggcacagacggggagaccgcgtaaagagaggtgcgccccgtggtcggcc-3’ChP和ChM分别对应实施例1中对照质粒pDR2p上的目标单链DNA的正链序列和反链序列。本实施例以ChP作为检测目标。单链DNA扩增实验组设计：1待检物ChP和ChM分别与启动引物R1610SEQIDNO.6、Taq酶、dATP、dTTP、dCTP、dITP混合，进行第1步单向PCR反应。2在上述反应体系中，加入选择引物AF1538SEQIDNO.7和dNTPdATP、dTTP、dGTP、dCTP，进行第2步选择性PCR反应。同时，对待检物ChP和ChM都按照实施例1设置阳性对照组和阴性对照组反应。按照实施例1中的PCR程序进行设置。将阳性对照组、阴性对照组和单链DNA扩增实验组的PCR产物进行电泳检测，结果如图6。其中，对图6中各电泳道说明如下：M：分子量Marker；Lane1：ChP-阳性对照反应；Lane2：ChP-阴性对照反应；Lane3：ChP-单链DNA扩增实验；Lane4：ChM-阳性对照反应；Lane5：ChM-阴性对照反应；Lane6：ChM-单链DNA扩增实验。阳性对照组Lane1、4都给出扩增条带，说明在常规PCR反应中，单链DNAChP或ChM，也就是单链的目标DNA链或是其互补DNA链，都可以作为模板，开始扩增，获得无差别的结果。阴性对照组Lane2、5都没有给出扩增条带，说明选择性引物AF1538具备选择性，不能与ChP或ChM配对，不能开始扩增。ChP扩增实验Lane3给出明显扩增条带，说明只有在有I插入、且形成了I与模板上C配对的新生的DNA链后，选择性引物AF1538和启动引物R1610才能开始扩增新生的DNA链。而在ChM扩增实验中Lane6，由于第1步单向PCR反应中，启动引物R1610并不能与ChM配对，无法开始延长；进而在第2步选择性PCR反应中，选择性引物AF1538和启动引物R1610没有正确的模板，也无法开始扩增。本实施例进一步证明了本方法的特异性，即只对目标单链DNA进行扩增，而不扩增目标DNA的互补序列。实施例3基于I插入的荧光定量检测为了定量检测目标DNA，并进一步高检测的特异性、选择性，可以在反应体系中加入特异性荧光探针，来进行荧光定量检测Q-PCR。单链DNA扩增实验组设计：1配制对照质粒的梯度稀释溶液，每5uL中各含有5ng、0.5ng、50pg、5pg、0.5pg、50fg、5fg、0.5fg的对照质粒，分别对应1.65E9、1.65E8、1.65E7、1.65E6、1.65E5、1.65E4、1.65E3、1.65E2个拷贝数。对照质粒pDR2p长度2950bp，计算分子量1.82E6Dalton。2将对照质粒的梯度稀释溶液5uL加入PCR反应体系含启动引物R1610SEQIDNO.6、Taq酶、dATP、dTTP、dCTP、dITP中，进行第1步单向PCR反应。3在上述反应体系中，加入选择性引物AF1538SEQIDNO.7，dNTPdATP、dTTP、dGTP、dCTP，和荧光探针P1558SEQIDNO.9，置于Q-PCR仪中进行第2步选择性PCR反应，并监控荧光信号。同时，设置不含有对照质粒的空白对照反应。荧光探针P1558SEQIDNO.9：5’-cgcggtctccccgtctgtgc-3’PCR反应程序设置为：第1步单向PCR反应：95℃120sec；16cycles×95℃15sec，55℃30sec，72℃30sec；第2步选择性PCR反应于厦门安普利生物工程有限公司Q-PCR仪GeneLight9800中进行：95℃120sec；45cycles×95℃，15sec；45℃，50sec。Q-PCR实验结果如图7所示。其中，空白对照无Ct值显示。梯度稀释样品的拷贝数对数与对应的Ct值进行拟合分析，结果如图8所示，R2为0.997，最低检测量为0.5fg，相当于165个质粒。本实施例证明了本发明所述的单链DNA扩增方法是可以用于荧光定量检测的。实施例4基于溴尿嘧啶BrU插入的DNA扩增本实施例提供一种基于溴尿嘧啶BrU插入的单链DNA特异性扩增。本实施例同样以实施例1中的对照质粒pDR2p正链序列中的区域SEQIDNO.2作为检测目标。单链DNA扩增实验设计：1对照质粒与启动引物R1610SEQIDNO.6和Taq酶、dATP、dGTP、dCTP、5-溴脱氧尿嘧啶核苷三磷酸5-Bromo-2’-deoxyuridine5’-triphosphate，CAS102212-99-7，BrdUTP进行第1步单向PCR反应。在这个反应中，由于体系中不含dTTP，DNA聚合酶在遇到模板上的A的时候只能插入BrU来与之配对。因此，形成了有BrU插入、且BrU与模板上A配对的新生的DNA链，R5-ChainSEQIDNO.10。R5-ChainSEQIDNO.10：5’-GGCGTTCACGGTGGTCTCCaBrUgcgacgBrUgcagaggBrUgaagcgaagBrUgcacacggBrUccggcagaBrUgagaaggcacagacggggagaccgcgBrUaaagagaggBrUgcgccccgBrUggBrUcggccggaacggcagacggagaaggggacggBrUagagccccaagcggccccgagacgggBrUcgBrUccgcgggaBrUBrUcagcgccgacgggacgBrUagacaaaggacgBrUccc-3’2在上述反应体系中，加入选择引物G1445SEQIDNO.11和dNTPdATP、dTTP、dGTP、dCTP，进行第2步选择性PCR反应。选择引物G1445SEQIDNO.11：5’-gtcccgtcggcgctgGG-3’在这个反应中，选择引物G1445末端的G与新生DNA链R5-Chain中的BrU进行配对后，选择性引物G1445和启动引物R1610才能开始扩增新生的DNA链。BrU可以与A配对、也可以与G配对，在有A、T、G、C等常用碱基脱氧核苷三磷酸存在的情况下，DNA聚合酶在BrU的对侧插入A或G，由此形成的R6-ChainSEQIDNO.12。其中，简并碱基R＝AG。R6-ChainSEQIDNO.12：5’-gtcccgtccggcgctgGGtcccgcggRcgRcccgtctcggggccgcttggggctctRccgtccccttctccgtctgccgttccggccgRccRcggggcgcRcctctctttRcgcggtctccccgtctgtgccttctcRtctgccggRccgtgtgcRcttcgcttcRcctctgcRcgtcgcRtggagaccaccgtgaacgcc-3’实施例5在有HBV-rcDNA存在的血清DNA样品中特异性检测目标DNA本实施例以对照质粒pDR2p正链SEQIDNO.1作为检测目标，模拟在有HBV-rcDNA存在的血清DNA样品中进行特异性检测HBV-cccDNA正链序列。实验样品设计如下：HBV-rcDNA样品：HBV-rcDNA是用厦门安普利HBV检测试剂盒产品注册号：国械注准20173404526从HBV患者的血清中提取制备并检测的。最终样品中HBV-rcDNA的浓度为1.47E5IU5uL。在PCR反应体系中加入5uL此样品，相当于加入1.47E5IU的HBV-rcDNA。Spike样品：在HBV-rcDNA样品的基础上，加入对照质粒pDR2p5ng，即1.65E9拷贝，用来模拟混有rcDNA的cccDNA样品。在PCR反应体系中加入5uL此样品，相当于加入1.47E5IU的HBV-rcDNA和1.65E9拷贝的对照质粒。分别对HBV-rcDNA样品和Spike样品进行如下检测实验：1HBV-rcDNA检测实验：使用常规HBV-DNA检测中与HBV-DNA的S序列完全配对的引物对SEQIDNO.13：5’-gacaaacgggcaacatacct-3’和SEQIDNO.14：5’-cctccaatcactcaccaacc-3’。这对引物将特异性地扩增rcDNA，而不会扩增对照质粒pDR2p。2对照质粒pDR2p检测实验：使用与对照质粒中目标序列完全配对的引物F1538SEQIDNO.8和与对照质粒上pUC57骨架序列完全配对的引物R161SEQIDNO.15，5’-GCTCACTCATTAGGCACCCC-3’。这对引物将特异性地扩增对照质粒pDR2p，而不会扩增rcDNA。3阴性对照实验常用碱基对照实验：使用启动引物R1610SEQIDNO.6和选择引物AF1538SEQIDNO.7，在反应体系中加入常规的dATP、dTTP、dGTP、dCTP混合液。4单链DNA扩增实验组设计：将待检样品与启动引物R1610SEQIDNO.6、Taq酶、dATP、dTTP、dCTP、dITP混合，进行第1步单向PCR反应。之后，在上述反应体系中，继续加入选择引物AF1538SEQIDNO.7和dNTPdATP、dTTP、dGTP、dCTP，进行第2步选择性PCR反应。按照实施例1设置PCR程序。将PCR产物进行电泳检测，结果如图9。其中，图9中各电泳道说明如下：M：分子量Marker；Lane1：HBV-rcDNA样品-对照质粒pDR2p检测实验；Lane2：HBV-rcDNA样品-HBV-rcDNA检测实验；Lane3：HBV-rcDNA样品-阴性对照实验；Lane4：HBV-rcDNA样品-单链DNA扩增实验；Lane5：Spike样品-对照质粒pDR2p检测实验；Lane6：Spike样品-HBV-rcDNA检测实验；Lane7：Spike样品-阴性对照实验；Lane8：Spike样品-单链DNA扩增实验；可以看到，在HBV-rcDNA检测实验的结果中，HBV-rcDNA样品Lane2和Spike样品Lane6都检测出明亮的153bp的扩增条带。说明两个样品中均含有HBV-rcDNA。在对照质粒pDR2p检测实验的结果中，HBV-rcDNA样品Lane1不含对照质粒pDR2p，没有扩增条带；而Spike样品Lane5给出了正确的331bp的扩增条带。说明我们已经建立了用来模拟混有rcDNA的cccDNA待检序列的样品。在阴性对照实验常用碱基对照实验结果中，HBV-rcDNA样品Lane3和Spike样品Lane7都没有给出扩增条带，证明了所用引物的特异性，即在常规的PCR条件下而不进行通用碱基插入替换时，启动引物R1610和选择引物AF1538是无法扩增目标序列的。在基于通用碱基插入替换的单链DNA扩增实验的结果中，Spike样品Lane8给出清晰的118bp目标条带，而HBV-rcDNA样品Lane4没有扩增条带。说明本发明所述的检测方法仅特异性地扩增目标单链DNA序列，即cccDNA正链序列，且不会受到样品中大量的rcDNA的影响。本实施例证明了本发明所述的单链DNA扩增方法是可以在有rcDNA存在的条件下对目标单链DNA进行特异性扩增的。实施例6在有HBV-rcDNA存在的血清DNA样品中特异性定量检测目标DNA为了定量检测目标DNA，并进一步高检测的特异性、选择性，可以在反应体系中加入特异性荧光探针，来进行荧光定量检测Q-PCR。单链DNA扩增实验组设计：1配制对照质粒的梯度稀释溶液，每5uL中各含有5pg、0.5pg、50fg、5fg、0.5fg的对照质粒，分别对应1.65E6、1.65E5、1.65E4、1.65E3、1.65E2个拷贝数。2将对照质粒的梯度稀释溶液5uL加入PCR反应体系含启动引物R1610SEQIDNO.6、Taq酶、dATP、dTTP、dCTP、dITP、3350IU的HBV-rcDNA中，进行第1步单向PCR反应。每个浓度设置3个重复反应。3在上述反应体系中，加入选择性引物AF1538SEQIDNO.7，dNTPdATP、dTTP、dGTP、dCTP，和荧光探针P1558SEQIDNO.9，置于Q-PCR仪中进行第2步选择性PCR反应，并监控荧光信号。按照实施例3设置PCR程序。Q-PCR实验结果如图10所示。梯度稀释样品的平均拷贝数对数与对应的Ct值进行拟合分析，结果如图11所示，R2为0.980，最低检测量为0.5fg，相当于165个质粒。本实施例证明了本发明所述的单链DNA扩增方法是可以在有rcDNA存在的条件下对目标单链DNA进行荧光定量检测的。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表厦门市安美捷生物工程有限公司基于通用碱基替换插入的HBV-cccDNA检测方法与试剂盒35SIPOSequenceListing1.01252DNA人工序列ArtificialSequence1gaattcgggacgtcctttgtctacgtcccgtcggcgctgaatcccgcggacgacccgtct60cggggccgcttggggctctaccgtccccttctccgtctgccgttccggccgaccacgggg120cgcacctctctttacgcggtctccccgtctgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcac180ttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcccaccggaacttgccca240aggtctgagctc2522118DNA人工序列ArtificialSequence2ggccgaccacggggcgcacctctctttacgcggtctccccgtctgtgccttctcatctgc60cggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcc1183118DNA人工序列ArtificialSequence3ggcgttcacggtggtctccatgcgacgtgcagaggtgaagcgaagtgcacacggtccggc60agatgagaaggcacagacggggagaccgcgtaaagagaggtgcgccccgtggtcggcc1184118DNA人工序列ArtificialSequence4ggaagaaaaaggggagaaaatatatttacgcggtctccccgtctgtgccttctcatctgc60cggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggagaccaccgtgaacgcc1185118DNA人工序列ArtificialSequence5ggcgttcacggtggtctccatgcgacgtgcagaggtgaagcgaagtgcacacggtccggc60agatgagaaggcacagacggggagaccgcgtaaatatattttctcccctttttcttcc118619DNA人工序列ArtificialSequence6ggcgttcacggtggtctcc19728DNA人工序列ArtificialSequence7ggaagaaaaaggggagaaaatatattta28820DNA人工序列ArtificialSequence8acggggcgcacctctcttta20920DNA人工序列ArtificialSequence9cgcggtctccccgtctgtgc2010218DNARNA人工序列ArtificialSequence10ggcgttcacggtggtctccaugcgacgugcagaggugaagcgaagugcacacgguccggc60agaugagaaggcacagacggggagaccgcguaaagagaggugcgccccguggucggccgg120aacggcagacggagaaggggacgguagagccccaagcggccccgagacgggucguccgcg180ggauucagcgccgacgggacguagacaaaggacguccc2181117DNA人工序列ArtificialSequence11gtcccgtcggcgctggg1712201DNA人工序列ArtificialSequence12gtcccgtccggcgctgggtcccgcggrcgrcccgtctcggggccgcttggggctctrccg60tccccttctccgtctgccgttccggccgrccrcggggcgcrcctctctttrcgcggtctc120cccgtctgtgccttctcrtctgccggrccgtgtgcrcttcgcttcrcctctgcrcgtcgc180rtggagaccaccgtgaacgcc2011320DNA人工序列ArtificialSequence13gacaaacgggcaacatacct201420DNA人工序列ArtificialSequence14cctccaatcactcaccaacc201520DNA人工序列ArtificialSequence15gctcactcattaggcacccc201619DNA人工序列ArtificialSequence16cgttcacggtggtctccat191719DNA人工序列ArtificialSequence17ttcacggtggtctccatgc191819DNA人工序列ArtificialSequence18acggtggtctccatgcgac191919DNA人工序列ArtificialSequence19ggtggtctccatgcgacgt192019DNA人工序列ArtificialSequence20tggtctccatgcgacgtgc192119DNA人工序列ArtificialSequence21gtctccatgcgacgtgcag192219DNA人工序列ArtificialSequence22ctccatgcgacgtgcagag192319DNA人工序列ArtificialSequence23ccatgcgacgtgcagaggt192428DNA人工序列ArtificialSequence24gtataggggaagattggggatataaagt282530DNA人工序列ArtificialSequence25gaaaaaggggagaaaatatatttaagaggt302628DNA人工序列ArtificialSequence26aagtataggggaagattggggatataaa282728DNA人工序列ArtificialSequence27aaggaagaaaaaggggagaaaatatatt282830DNA人工序列ArtificialSequence28aagaaaaaggggagaaaatatatttaagag302923DNA人工序列ArtificialSequence29aaaaaggggagaaaatatattta233020DNA人工序列ArtificialSequence30ggaagaaaaaggggagaaaa203121DNA人工序列ArtificialSequence31tctccccgtctgtgccttctc213219DNA人工序列ArtificialSequence32cggggccgcttggggctct193321DNA人工序列ArtificialSequence33gtccccttctccgtctgccgt213420DNA人工序列ArtificialSequence34ccgtccccttctccgtctgc203520DNA人工序列ArtificialSequence35kckccakakkkkcakacack20

权利要求：1.一种基于通用碱基插入替换的HBV-cccDNA特异性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：设计启动引物：所述启动引物与cccDNA正链配对，所述与cccDNA正链配对的序列位于HBV-DNA序列中DR2区域的下游；第1步PCR反应：加入所述启动引物，以cccDNA正链为模板，开始单向PCR反应，得到新生的单链DNA分子；所述新生的单链DNA分子中常用碱基A、T、G、C中的一种被替换为通用碱基；所述的通用碱基是可以与至少两种常用碱基进行互补配对的碱基；设计选择引物：所述选择引物与新生的单链DNA分子的3’端配对，其对应的序列位于HBV-DNA序列中DR2区域上游；第2步PCR反应：加入所述选择引物，对第1步PCR反应中所述新生的单链DNA分子进行选择性扩增，得到选择性扩增的产物；所述的选择引物能够与新生的单链DNA分子配对，但是不能与cccDNA的互补序列配对；定性或定量检测第2步PCR反应中所述的选择性扩增的产物。2.根据权利要求1所述的HBV-cccDNA的特异性检测方法，其特征在于，在第1步单向PCR反应体系中，加入的脱氧核苷三磷酸为dATP、dTTP、dGTP、dCTP中的任意3种，和1种通用碱基脱氧核苷三磷酸；在这一步的PCR延长反应中，DNA聚合酶催化通用碱基插入新生的DNA链，新生的单链DNA分子中常用碱基A、T、G、C中的一种被替换为通用碱基。3.根据权利要求1所述的HBV-cccDNA的特异性检测方法，其特征在于，所述通用碱基选自：次黄嘌呤、嗅尿嘧啶、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或7-氮杂吲哚。4.根据权利要求1～3任一项所述的HBV-cccDNA的特异性检测方法，其特征在于，在第1步单向PCR反应体系中，加入dATP、dTTP、dCTP和次黄嘌呤脱氧核苷三磷酸dITP；在这一步的PCR延长反应中，DNA聚合酶催化次黄嘌呤脱氧核苷插入新生的DNA链，新生的单链DNA分子中的碱基G被替换为I；和或在第2步选择性PCR反应体系中，加入的选择引物是用腺嘌呤A与新生的单链DNA分子中对应位点的I进行配对，可以启动选择性扩增得到产物；选择引物不能与对应位点为胞嘧啶C的目标单链DNA互补序列进行配对。5.根据权利要求1～3任一项所述的HBV-cccDNA的特异性检测方法，其特征在于，所述启动引物选自：SEQIDNO.6、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、SEQIDNO.18、SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22或SEQIDNO.23；和或所述选择引物选自：SEQIDNO.7、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.29或SEQIDNO.30。6.根据权利要求1～3任一项所述的HBV-cccDNA的特异性检测方法，其特征在于，所述定性或定量检测的方法包括：电泳法、荧光染料法、荧光探针法、荧光原位杂交法。7.根据权利要求6所述的HBV-cccDNA的特异性检测方法，其特征在于，所述定性或定量检测中，检测用的探针的核苷酸序列选自：SEQIDNO.9、SEQIDNO.31、SEQIDNO.32、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34或SEQIDNO.35；所述探针标记有荧光基团和淬灭基团。8.一种HBV-cccDNA的特异性检测试剂盒，其特征在于，包含有：引物、dATP、dTTP、dGTP、dCTP、通用碱基脱氧核苷三磷酸；所述引物包括：如权利要求1～7任一项所述的引物启动引物和选择引物。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述启动引物选自：SEQIDNO.6、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、SEQIDNO.18、SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22或SEQIDNO.23；和或所述选择引物选自：SEQIDNO.7、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.29或SEQIDNO.30；和或所述通用碱基脱氧核苷三磷酸中的通用碱基选自：次黄嘌呤、嗅尿嘧啶BrU、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、7-氮杂吲哚。10.如权利要求1～7任一项所述的HBV-cccDNA的特异性检测方法或如权利要求8或9所述的HBV-cccDNA的特异性检测试剂盒在检测HBV中的应用。

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