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申请/专利权人：呈诺再生医学科技(北京)有限公司

摘要：本发明属于生物医药领域，具体涉及一种通过调节NGN3表达促进iPSC向胰岛细胞分化的方法。具体地，本发明通过在诱导细胞分化过程中梯度浓度添加重组人激活素AActivinA和添加CK‑666上调NGN3的表达，促进iPSC向胰岛细胞分化。

主权项：1.一种培养基组合物，所述培养基组合物由以下培养基组成：1）第一培养基A：由重组人激活素A、CHIR-99021、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；所述重组人激活素A的工作浓度为115ngmL，所述CHIR-99021的工作浓度为3µM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5gL；2）第一培养基B：由重组人激活素A、CHIR-99021、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；所述重组人激活素A的工作浓度为110ngmL，所述CHIR-99021的工作浓度为3µM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5gL；3）第一培养基C：由重组人激活素A、CHIR-99021、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；所述重组人激活素A的工作浓度为100ngmL，所述CHIR-99021的工作浓度为3µM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5gL；4）第二培养基：由抗坏血酸、FGF-7、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述FGF-7的工作浓度为50ngmL，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5gL；5）第三培养基：由抗坏血酸、FGF-7、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物TPPB、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述FGF-7的工作浓度为50ngmL，所述SANT-1的工作浓度为0.25µM，所述视黄酸的工作浓度为1µM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%，所述蛋白激酶C活化物TPPB的工作浓度为200nM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为2.5gL；6）第四培养基：由抗坏血酸、FGF-7、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物TPPB、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述FGF-7的工作浓度为2ngmL，所述SANT-1的工作浓度为0.25µM，所述视黄酸的工作浓度为1µM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%，所述蛋白激酶C活化物TPPB的工作浓度为200nM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为2.5gL；7）第五培养基：SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5iII、硫酸锌、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、基础培养基组成；所述SANT-1浓度的工作浓度为0.25µM，所述视黄酸的工作浓度为0.1µM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%，所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM，所述ALK5抑制剂ALK5iII的工作浓度为10µM，所述硫酸锌的工作浓度为10µM，所述肝素的工作浓度为10µgmL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5gL，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；8）第六培养基A：由细胞黏附抑制剂CK-666、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5iII、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂GSiXX、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、基础培养基组成；所述培养基中CK-666的工作浓度为100µM，所述LDN193189的工作浓度为100nM；所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%；所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM；所述ALK5抑制剂ALK5iII的工作浓度为10µM；所述硫酸锌的工作浓度为10µM；所述γ-分泌酶抑制剂GSiXX的工作浓度为100nM，所述肝素的工作浓度为10µgmL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5gL，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；9）第六培养基B：由LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5iII、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂GSiXX、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、基础培养基组成；所述培养基中LDN193189的工作浓度为100nM；所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%；所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM；所述ALK5抑制剂ALK5iII的工作浓度为10µM；所述硫酸锌的工作浓度为10µM；所述γ-分泌酶抑制剂GSiXX的工作浓度为100nM，所述肝素的浓度的工作浓度为10µgmL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5gL，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；10）第六培养基C：由LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5iII、硫酸锌、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、基础培养基组成；所述LDN193189的工作浓度为100nM；所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%；所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM；所述ALK5抑制剂ALK5iII的工作浓度为10µM；所述硫酸锌的工作浓度为10µM；所述肝素的工作浓度为10ugmL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5gL，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；11）第七培养基，所述第七培养基：由胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5iII、硫酸锌、肝素、乙酰-l-半胱氨酸、水溶性维生素E和Axl抑制剂R428、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、基础培养基组成；所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5%，所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1µM，所述ALK5抑制剂ALK5iII的工作浓度为10µM，所述硫酸锌的工作浓度为10µM，所述肝素的工作浓度为10µgmL，所述乙酰-l-半胱氨酸的工作浓度为1mM，所述水溶性维生素E的工作浓度为10µM，所述Axl抑制剂R428的工作浓度为2µM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5gL，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2%；所述基础培养基是MCDB131。

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