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申请/专利权人：闽江学院

摘要：本发明公开海水多毛类参与再生功能的重组蛋白的原核表达纯化方法；本发明利用全基因合成基因序列并通过PCR扩增将含有限制性内切酶位点的产物插入到质粒中，构建pET‑30a‑His‑OxLumbricin原核表达载体；在温度为15℃，0.5mMIPTG的条件下诱导下16h；分别对全细胞、上清和沉淀进行检测，最终得到分子量为12kD的蛋白大量分布在裂解上清液中，表明目的蛋白呈可溶性表达，进一步纯化后获得纯度较高的OxLumbricin蛋白，本发明可为今后研究OxLumb蛋白在海洋动物尤其是海洋无脊椎动物再生的作用机制和蛋白功能研究提供材料。

主权项：1.海水多毛类参与再生功能的重组蛋白的原核表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：1序列合成根据OxLumbricin核酸序列，在两端分别添加NdeI和HindIII核酸酶切位点及保护碱基，在OxLumbricin蛋白的N端添加6个组氨酸标签，进行人工合成His-OxLumbricin序列；2PCR扩增将合成的His-OxLumbricin基因序列连接于pMD-19T克隆载体，适量稀释后，以其为模板、利用克隆载体通用引物和Takara高保真ExTaq酶进行PCR反应，所获PCR产物送公司测序，验证后的片段用于双酶切反应；3PCR扩增产物双酶切利用NdeI和HindIII，对经过步骤2的扩增产物进行双酶切，以获得His-OxLumbricin基因序列中具有粘性末端的目的片段；4pET-30a+质粒的提取及双酶切将含有原核表达载体pET-30a+质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基中进行培养后，用质粒提取试剂盒提取质粒；利用EcoRI和HindIII，对提取的pET-30a+质粒进行双酶切，以获得具有与His-OxLumbricin基因序列中相同粘性末端的原核表达载体片段；5重组表达质粒pET-30a-His-OxLumbricin的构建连接经过步骤3双酶切获得的His-OxLumbricin基因目的片段与步骤4双酶切处理获得的原核表达载体片段：6重组表达质粒pET-30a-His-OxLumbricin的转化构建的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21DE3中，转化后菌液接种于LB液体培养基中，振荡培养后涂至卡那霉素抗性平板上，进行抗性筛选；7pET-30a-His-OxLumbricin重组蛋白的表达及鉴定挑选带有重组表达质粒的表达菌株E.coliBL21DE3，接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养，当OD600达到0.6～0.8时，加入IPTG，并继续振荡培养，诱导表达；8进行SDS-PAGE和WesternBlot分析；9His-OxLumbricin纯化：诱导表达结束后，先将上清液过滤后，再用镍亲和层析法进行纯化。

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