申请/专利权人：中国热带农业科学院三亚研究院;河北省农林科学院谷子研究所

申请日：2023-09-26

公开（公告）日：2024-01-23

公开（公告）号：CN117004649B

主分类号：C12N15/84

分类号：C12N15/84;A01H4/00;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/46

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.01.23#授权;2023.11.24#实质审查的生效;2023.11.07#公开

摘要：本发明提供一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，属于植物生物技术领域，所述方法是以糜子成熟种子诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，通过农杆菌介导法转化含有外源基因的植物表达载体，以潮霉素抗性基因（hptIIgene）作为筛选标记，用潮霉素进行抗性愈伤和再生植株的筛选，最后得到具有潮霉素抗性的再生糜子植株。本发明首次建立了农杆菌介导的糜子遗传转化方法，该方法获得的抗性再生植株PCR鉴定的阳性率为100%，平均转化效率30%以上，转化周期为12~16周，整体操作简单，转化效率高，成本低廉，且转化不受季节限制，能规模化开展，为糜子的遗传改良提供了有效的技术手段。

主权项：1.一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）胚性愈伤诱导和农杆菌活化；糜子成熟种子诱导糜子的胚性愈伤诱导组织；诱导过程中，先接种于胚性愈伤诱导培养基上，先光照发芽，发芽后进行暗培养20~30d，从芽点处挑取组织致密、非水渍状的胚性愈伤组织，再转接于新的胚性愈伤诱导培养基，继续培养7d后，得所述胚性愈伤诱导组织；取含有hptII基因筛选标记的植物表达载体的农杆菌菌株制备活化农杆菌菌液；所述农杆菌为AGL1农杆菌；制备活化农杆菌菌液过程中，使用的侵染液是大量元素减半的MS培养基，并添加蔗糖、吗啉乙磺酸、乙酰丁香酮和表面活性剂，pH值为5.4；2）侵染和共培养胚性愈伤诱导组织经活化农杆菌菌液侵染后，所得经侵染的糜子胚性愈伤组织转接到共培养培养基上进行暗培养，得共培养后糜子胚性愈伤组织；3）抗性愈伤的筛选将共培养后糜子胚性愈伤组织转移至含有抑制农杆菌的抗生素和筛选剂潮霉素的愈伤筛选培养基中，经两次继代后，得抗性愈伤组织；所述愈伤筛选培养基是MS培养基，并添加微量元素ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、kinetin、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖、植物凝胶、抑制农杆菌的抗生素和筛选剂潮霉素；其中潮霉素的浓度为0.02~0.03gL；4）分化和生根抗性愈伤组织经两次分化培养，所得分化幼苗接入生根培养基中进行生根培养，待生根完成后，得抗性再生植株；所述两次分化培养是取抗性愈伤组织转移至第一阶段分化培养基中进行培养，再转接至第二阶段分化培养基中进行培养，即得所述分化幼苗；所述第一阶段分化培养基是改良的MS培养基，MS微量元素和维生素加倍，并添加6-苄氨基嘌呤、kinetin、2,4-二氯苯氧乙酸、椰子水、抑制农杆菌的抗生素、筛选剂潮霉素、软骨素和植物凝胶；其中，潮霉素的浓度为0.012~0.02gL、6-苄氨基嘌呤的浓度为0.003gL、kinetin的浓度为0.003gL、2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.001gL；所述第二阶段分化培养基是MS微量元素和维生素加倍的MS培养基，并添加6-苄氨基嘌呤、kinetin、2,4-二氯苯氧乙酸、椰子水、抑制农杆菌的抗生素、筛选剂潮霉素、软骨素和植物凝胶；其中，潮霉素的浓度为0.012~0.02gL、6-苄氨基嘌呤的浓度为0.001gL、kinetin的浓度为0.001gL、2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.0005gL；所述生根培养基是大量元素减半的MS培养基，MS微量元素和维生素加倍，并添加蔗糖、3-吲哚丁酸、抑制农杆菌的抗生素、筛选剂潮霉素和植物凝胶；其中潮霉素的浓度为0.012~0.02gL。

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