申请/专利权人：福建农林大学

申请日：2023-11-09

公开（公告）日：2024-02-06

公开（公告）号：CN117511992A

主分类号：C12N15/82

分类号：C12N15/82;A01H5/00;A01H6/00

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.02.27#实质审查的生效;2024.02.06#公开

摘要：本发明公开一种农杆菌介导紫叶酢浆草叶柄稳定遗传转化的方法。所述方法包括以下步骤：无菌苗的获得及继代；外植体预培养；侵染液制备；侵染；共培养；洗菌与筛选；抗性植株检测。本发明的有益效果是：通过外植体消毒方法、侵染受体、预培养时间、侵染液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度、共培养时间等因素的优化，降低了外植体污染率、提高了GUS瞬时表达率、抗性愈伤率及转基因植株阳性率。本发明转化效率高，操作简单且耗时短，对于建立其他酢浆草属植物的稳定遗传转化体系有重要指导意义，并可促进酢浆草观赏性状相关功能基因的分子机制研究和工程改造。

主权项：1.一种农杆菌介导紫叶酢浆草叶柄稳定遗传转化的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1）无菌苗的获得及继代：取紫叶酢浆草幼嫩叶柄，经消毒除菌后切成5±0.50mm的小段，接种到M1培养基中培养60~120d，获得可用于继代培养的紫叶酢浆草无菌苗；将获得的可用于继代培养的紫叶酢浆草无菌苗的基部丛生叶柄截成0.5~1cm的小段，接种到M1培养基中培养60~120d，获得用于继续继代的紫叶酢浆草无菌苗；2）外植体预培养：选取经继代1次以上、生长健壮的紫叶酢浆草无菌苗叶柄，切成5±0.50mm的小段后接种到M1培养基中培养2~5d，获得预培养后的紫叶酢浆草叶柄；3）侵染液制备：将含有GUS报告基因的农杆菌单菌落接种于1mL含50mgL卡那霉素和25mgL利福霉素的LB液体培养基中，28℃、200rpm摇床振荡培养6h，而后按1:50vv的比例转接到50mL含50mgL卡那霉素和25mgL利福霉素的LB液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养12~16h，4000rpm室温离心10min，收集菌体用MS液体培养基润洗，然后用含100~400μM乙酰丁香酮的IM重悬液重悬至OD600值为0.4~1.0，室温避光静置2~3h，得到用于侵染的侵染液；4）侵染：将预培养后的紫叶酢浆草叶柄置于侵染液中进行侵染，侵染时间为5~20min，得到侵染后的紫叶酢浆草叶柄；5）共培养：将侵染后的紫叶酢浆草叶柄置于无菌滤纸上，吹干表面菌液后接种到M2培养基中培养2~5d，得到共培养后的紫叶酢浆草叶柄；6）洗菌与筛选：将共培养后的紫叶酢浆草叶柄依次用无菌水清洗1min、500mgL头孢水清洗2min、无菌水清洗1min、250mgL头孢水清洗2min、无菌水清洗2次每次1min，去除表面水分，然后接种到M3培养基中培养30d，叶柄边缘有愈伤组织长出，检测后选取抗性愈伤接种至M4培养基中继续培养，至分化出抗性植株；7）对分化出的抗性植株进行遗传转化情况的检测；其中，所述M1培养基配方为：MS液体培养基+1mgL6-BA+0.5mgLNAA+30gL蔗糖+7gL琼脂+0.05gL活性炭；所述M2培养基配方为：MS液体培养基+1mgL6-BA+0.5mgLNAA+30gL蔗糖+7gL琼脂+0.05gL活性炭+200μmolL乙酰丁香酮；所述M3培养基配方为：MS液体培养基+1mgL6-BA+0.5mgLNAA+0.8mgL潮霉素+200mgL羧苄青霉素+30gL蔗糖+7gL琼脂+0.05gL活性炭；所述M4培养基配方为：MS液体培养基+1mgL6-BA+0.5mgLNAA+1mgL潮霉素+100mgL羧苄青霉素+30gL蔗糖+7gL琼脂+0.05gL活性炭。

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