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申请/专利权人：浙江省检验检疫科学技术研究院

摘要：本发明公开了一种红木中奥氏黄檀的鉴定方法、引物和探针及其应用。所述引物和探针具有奥氏黄檀的专属特异性。本发明检测样本量少，以木材特有的DNA信息为依据，能快速、准确、客观地获得奥氏黄檀的种属鉴定结果，避免了传统鉴定方法主观性强以及必须建立在所检木材有完整易辨识的形态结构基础上的缺陷，实现奥氏黄檀检测的高特异性和高灵敏度。因此本发明可用于农林、工商、检验检疫等相关部门进行执法检测，同时也可以用于第三方检测机构的消费者维权鉴定之用。对规范市场，保护消费者权益，促进物种资源的保护和利用具有重要的意义。

主权项：1.用于奥氏黄檀的分子鉴定方法的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列包括：ASHTPrimer-F：5'-GTTTCTATTGCTCCTTTACTTT-3'ASHTPrimer-R：5'-TCTGTTTCTTCTCTAACTTTAGT-3'ASHTPrimerProbe：5'-FAM-TACATTGCAAATTCATATG-MGB-3'。

全文数据：奥氏黄檀的分子鉴定方法及其引物和探针技术领域本发明涉及木材材种鉴定的分子生物学检测领域，具体地说涉及对奥氏黄檀的分子鉴定方法及其所使用的引物和探针。背景技术近年来，由于红木家具受到越来越多消费者的喜爱，促进了红木家具制造业的繁荣，因此红木木材的进口量也随之逐年增加。但是，长期以来由于受利益驱使，红木市场良莠不齐，掺假造假情况突出：一方面用较次的红木冒充较好的红木，另一方面用非红木冒充红木等。奥氏黄檀DalbergiaoliveriPrain隶属于豆科黄檀属红酸枝木类，主产于泰国、缅甸和老挝。商品名为Burmatulipwood。是新国家标准GBT18107-2017《红木》中的一种。奥氏黄檀和巴里黄檀D.bariensis在GBT18107-2017《红木》中同为红酸枝木类。这两种黄檀无论是构造特征、木材密度、市场价格或产地都十分相似，一般木材商及红木家具厂家很难将其区分出来。市场上将奥氏黄檀称为“白枝”，巴里黄檀称为“花酸枝”或“花枝”。两种木材在价格上存在巨大的差额。正是由于形态特征相似或相近，导致不法分子将一些容易混淆和不易区分的树种和木材制品冒充奥氏黄檀进行销售，极大地扰乱了市场秩序，给消费者带来了巨大的经济损失。传统的红木鉴定识别方法是利用人工经验进行识别，主要通过对木材截面进行人工观察的方式完成。一般情况下依赖肉眼和放大镜进行宏观识别，而微观识别则需要使用光学显微镜观察其内部的解剖结构特征，也就是观察构成木材的各类细胞与组织的形态及排列特征，该方法涉及的识别特征较多，鉴定相对准确，但对于鉴定工作者的要求很高，要对此做出准确的鉴定，必须具有丰富的实践经验。近年来研究工作者开发了基于数字图像处理的木材图像识别技术，大大提高了木材识别的准确性，推动了木材识别技术的发展。但是，无论是基于识别者经验的传统识别技术还是基于计算机图像检索的识别技术，都没有脱离木材本身的形态结构及特征，鉴定识别工作都必须建立在所检木材有完整易辨识的形态结构的基础上，这就为木材识别工作带来了一定的局限性，同时，相近种属木材易出现材质结构的相似，为木材识别的准确性带来困难。目前对奥氏黄檀的鉴定依然采用传统的木材鉴定手段，即解剖切片观察木材的构造以及形态特征从而得出判定结果。因此建立起以DNA基因信息为基础的分子鉴定方法，实现奥氏黄檀的简单、快速、准确、客观的鉴定是目前急需解决的问题。发明内容本发明提供一种用于奥氏黄檀的分子鉴定方法的引物和探针，所述引物和探针序列包括：ASHTPrimer-F：5'-GTTTCTATTGCTCCTTTACTTT-3'ASHTPrimer-R：5'-TCTGTTTCTTCTCTAACTTTAGT-3'ASHTPrimerProbe：5'-FAM-TACATTGCAAATTCATATG-MGB-3'。进一步地，所述引物和探针的PCR反应条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。进一步地，所述引物和探针的使用浓度比为：ASHTPrimer-F:ASHTPrimer-R:ASHTPrimerProbe＝1:1:2本发明还提供了一种用于奥氏黄檀的分子鉴定的方法，包括如下步骤：1木材样本的预处理；2提取经1处理后的木材样本中的DNA；3利用引物ASHTPrimer-F和ASHTPrimer-R，以及探针ASHTPrimerProbe对2中提取的DNA进行荧光PCR扩增；4木材种类的确定；所述引物和探针序列包括：ASHTPrimer-F：5'-GTTTCTATTGCTCCTTTACTTT-3'ASHTPrimer-R：5'-TCTGTTTCTTCTCTAACTTTAGT-3'ASHTPrimerProbe：5'-FAM-TACATTGCAAATTCATATG-MGB-3'。进一步地，所述的荧光PCR扩增条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。本发明还提供了ASHTPrimer-F、ASHTPrimer-R和ASHTPrimerProbe引物和探针在鉴定奥氏黄檀荧光定量PCR上的应用。本发明还提供了一种用于奥氏黄檀的分子鉴定的试剂盒，所述试剂盒中包括下列引物和探针：ASHTPrimer-F：5'-GTTTCTATTGCTCCTTTACTTT-3'ASHTPrimer-R：5'-TCTGTTTCTTCTCTAACTTTAGT-3'ASHTPrimerProbe：5'-FAM-TACATTGCAAATTCATATG-MGB-3'。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：本发明通过一对特异性扩增引物及MGB探针对目的基因进行扩增，条件依赖少，一般的PCR实验室设备即可满足，对结果的分析非常直观，不用比对复杂的测序图谱，直接根据扩增曲线即可做出分析该位点基因型。本发明所采用的荧光定量PCR法MGB探针检测周期短，在三个小时内即可得出结果，而且相对于DNA测序法来说检测灵敏度大大提高。实时荧光定量PCR技术具有较高的灵敏度和特异性，而且能对扩增产物进行实时检测。该法综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，易于统一标准。使用MGB探针还能极大地降低本底信号的干扰，还可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm值，允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。与此同时MGB探针对于等位基因的区分比较理想，具有非常好的准确性和特异性。本发明在对奥氏黄檀大量基因信息进行分析比较的基础上，并根据序列位点多态性，设计了奥氏黄檀特异性引物和探针，建立了实时荧光定量PCR技术对奥氏黄檀分子水平上的鉴定。本发明并不需要木材有完整的形态结构，只需从木料上取极少量木材样本，即可满足检测要求，操作简单。并且通过木材特有的DNA信息做出判断，鉴定过程客观、准确。克服了传统鉴定方法主要依赖于形态鉴定方法，并必须建立在木材有完整易辨识的形态结构基础上的技术局限性。本发明采用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对奥氏黄檀检测的高特异性和高灵敏度。本发明很好地满足农林、工商、检验检疫、第三方鉴定机构等各相关部门对奥氏黄檀快速筛查和鉴定的要求，能有效杜绝奥氏黄檀制品的掺假造假行为，对于保护消费者权益，提高品牌价值，规范市场，促进物种资源的保护和利用具有重要的意义。附图说明图1是奥氏黄檀和11个对照组树种DNA提取效果实验。图2是特异性实验结果图。图3是灵敏度实验结果图。图4是针对经不同处理方式得到的木材样本的检测结果图。图5是木材不同部位的鉴定实验。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照商品说明书建议的步骤和条件。实施例1检测奥氏黄檀的引物、探针和检测试剂盒利用NCBI等资源信息，找出奥氏黄檀与其他木材的基因差异位点，筛选出一对特异性扩增引物对ASHTPrimer-F和ASHTPrimer-R，并在该引物对的扩增区域设定了一条特异性的探针ASHTPrimerProbe。所述扩增引物对和探针序列分别是：ASHTPrimer-F：5'-GTTTCTATTGCTCCTTTACTTT-3'ASHTPrimer-R：5'-TCTGTTTCTTCTCTAACTTTAGT-3'ASHTPrimerProbe：5'-FAM-TACATTGCAAATTCATATG-MGB-3'。将所设计的引物和探针在NCBI上进行同源性比对，结果显示所述引物和探针序列只与奥氏黄檀序列100％相似，无法与其他树种序列进行有效的结合，从而只能扩增和检测出奥氏黄檀。一种检测奥氏黄檀的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、qPCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。其中所述引物和探针序列分别为：ASHTPrimer-F：5'-GTTTCTATTGCTCCTTTACTTT-3'ASHTPrimer-R：5'-TCTGTTTCTTCTCTAACTTTAGT-3'ASHTPrimerProbe：5'-FAM-TACATTGCAAATTCATATG-MGB-3'。阳性对照品：含有本发明所述的特异性扩增片段的质粒溶液。阴性对照品：不含本发明所述的特异性扩增片段的质粒溶液。空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质的ddH2O。实施例2：实时荧光PCR的鉴定方法1木材样本的预处理：用75％的乙醇对木材表面进行彻底的消毒，经无菌水冲洗并用擦干木材。切除待测木材表面部分以避免其他植物组织的污染。取一定量的木材样本，在预冷的研钵中加入液氮和石英砂研磨成粉末备用。当不立即使用时，样品DNA溶液在-20℃下保存待用。2木材样本DNA提取：采用植物基因组提取试剂盒PlantGenomicDNAKit，TIANGEN提取步骤1中预处理的木材总DNA，置于-40℃冰箱中备用。3实时荧光PCR扩增：将步骤2中提取的DNA进行qPCR检测。其中扩增条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。本实施例所述qPCR扩增是在ABI公司的ABI7500RealTimePCRSystem完成。也可以在其他的扩增仪器上完成。其中，qPCR扩增反应体系为：20μl的体系包括：4确定木材种类根据荧光PCR扩增结果确定木材样品的种类。实施例3：DNA提取与检测分别提取奥氏黄檀实验组1、对照组：降香黄檀、刀状黑黄檀、阔叶黄檀、卢氏黑黄檀、东非黑黄檀、亚马孙黄檀、伯利兹黄檀、巴里黄檀、交趾黄檀、中美洲黄檀、微凹黄檀，总共11个对照的基因组DNA作为模板，利用植物內源基因tRNALeu及实施例1的反应体系和实施例2所述的检测方法，对提取的DNA进行检测。tRNALeu的引物和探针序列分别为标准：tRNALeu-F：5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'tRNALeu-R：5'-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3'tRNALeuProbe：5'-FAM-GCAATCCTGAGCCAAATCC-TAMRA-3'如图1表明实施例3中实验组和对照组样本的DNA均已经被成功提取。其中，各树种的拉丁名称分别为：奥氏黄檀D.oliveri，降香黄檀D.odorifera，刀状黑黄檀D.cultrata，阔叶黄檀D.latifolia，卢氏黑黄檀D.louvelii，东非黑黄檀D.melanoxylon，亚马孙黄檀D.spruceana，伯利兹黄檀D.stevensonii，巴里黄檀D.bariensis，交趾黄檀D.cochinchinensis，中美洲黄檀D.granadillo，微凹黄檀D.retusa。实施例4：荧光PCR扩增的特异性以实施例3提取DNA作为模版，实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法，进行奥氏黄檀荧光PCR检测的特异性实验。如图2所示实验结果表明，本发明所述的引物、探针和方法能扩增出奥氏黄檀。而同属的降香黄檀、刀状黑黄檀、阔叶黄檀、卢氏黑黄檀、东非黑黄檀、亚马孙黄檀、伯利兹黄檀、巴里黄檀、交趾黄檀、中美洲黄檀、微凹黄檀均为阴性，均不能被扩增。因此本发明所述引物、探针和方法能够检测出奥氏黄檀，检测特异性好。另外，将本实施例实验组和对照组的完整木材用传统的鉴定方法作进一步确认实验。结果表明，利用本发明所述分子鉴定方法确认的结果准确。由此可见，本发明具有很好的特异性。实施例5：荧光PCR扩增的灵敏度以同一根干燥的奥氏黄檀木材为材料，烘干至恒重，然后分别以0.1g、0.5g、1.0g和2.0g取样，利用实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。图3所示，随着样品量的增加，本方法提取的木质部基因组DNA的产量成线性增加，对应qPCR的Ct值成比例下降，样品取样量与结果对应性强。实验结果表明，利用本发明所述的引物和探针，可以检测出样品量仅为0.1g的DNA信息。由于本发明所述分子鉴定方法只需要极少量的木材样本就可完成检测，它并不依赖于木材的形态结构是否完整。因此本发明不仅可以对形态完整的奥氏黄檀进行鉴定，还可以对看不出原始形态的奥氏黄檀加工成品或半成品等进行鉴定。例如能对以奥氏黄檀为原材料的红木家具成品进行客观地鉴定，且对家具本身并没有造成破坏，家具依然保持原先的设计状态。实施例6：检测经不同处理方式得到的木材样本选用的木材样本分别来自：利用25℃和65℃两种温度干燥的奥氏黄檀木材；潮湿木材，即受潮的木材；分别采用挤压、熏蒸或气干处理的木材。利用实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。如4所示的实验结果表明本发明所述的引物和探针，可以准确地分析出利用不同方法处理后的奥氏黄檀的DNA情况。其中图中的A、B、C、D分别表示A：干燥木材；B：潮湿木材；C：挤压木材；D：熏蒸木材；E：气干木材。实施例7：木材不同部位的鉴定实验分别取奥氏黄檀的边材与心材，按实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。如图5示实验结果表明：本发明所述方法可以以不同部位的材质作为检测的样品，且检测结果准确。因此，无论以奥氏黄檀的哪个部位作为红木制品的原材料，本发明所述方法都适用。进一步说明：边材1Sapwood1外围部分，边材2Sapwood2表示边材内部靠近心材的部分；心材1Heartwood1和心材2Heartwood2表示心材的最中心部分。边材：树木次生木质部的外围活层，位于树干的外围部分，细胞中水分较心材多，色浅，较软，无心材中常见深色沉积物质。心材：多年生的树木其近中心部分的木材，不含生活细胞，其贮藏物质已不存在或转化为心材物质，色深，材质较硬且致密，含水量少，无输导输液与贮藏营养物质的功能，主要对整株植物起支持作用。商业上心材通常指树心部分有显著材色者。序列表浙江省检验检疫科学技术研究院奥氏黄檀的分子鉴定方法及其引物和探针3SIPOSequenceListing1.0122DNA人工合成Artificialsynthesis1gtttctattgctcctttacttt22223DNA人工合成Artificialsynthesis2tctgtttcttctctaactttagt23419DNA人工合成Artificialsynthesis4tacattgcaaattcatatg19

权利要求：1.用于奥氏黄檀的分子鉴定方法的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列包括：ASHTPrimer-F：5'-GTTTCTATTGCTCCTTTACTTT-3'ASHTPrimer-R：5'-TCTGTTTCTTCTCTAACTTTAGT-3'ASHTPrimerProbe：5'-FAM-TACATTGCAAATTCATATG-MGB-3'。2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的PCR反应条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的使用浓度比为：ASHTPrimer-F:ASHTPrimer-R:ASHTPrimerProbe＝1:1:2。4.用于奥氏黄檀的分子鉴定的方法，包括如下步骤：1木材样本的预处理；2提取经1处理后的木材样本中的DNA；3利用引物ASHTPrimer-F和ASHTPrimer-R，以及探针ASHTPrimerProbe对2中提取的DNA进行荧光PCR扩增；4木材种类的确定；其特征在于，所述引物和探针序列包括：ASHTPrimer-F：5'-GTTTCTATTGCTCCTTTACTTT-3'ASHTPrimer-R：5'-TCTGTTTCTTCTCTAACTTTAGT-3'ASHTPrimerProbe：5'-FAM-TACATTGCAAATTCATATG-MGB-3'。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的荧光PCR扩增条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。6.引物和探针在鉴定奥氏黄檀荧光定量PCR上的应用，其特征在于，所述引物和探针序列包括：ASHTPrimer-F：5'-GTTTCTATTGCTCCTTTACTTT-3'ASHTPrimer-R：5'-TCTGTTTCTTCTCTAACTTTAGT-3'ASHTPrimerProbe：5'-FAM-TACATTGCAAATTCATATG-MGB-3'。7.一种用于奥氏黄檀的分子鉴定的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包括下列引物和探针：ASHTPrimer-F：5'-GTTTCTATTGCTCCTTTACTTT-3'ASHTPrimer-R：5'-TCTGTTTCTTCTCTAACTTTAGT-3'ASHTPrimerProbe：5'-FAM-TACATTGCAAATTCATATG-MGB-3'。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括样品DNA抽提试剂、qPCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。

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