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申请/专利权人：安顺学院

摘要：本发明公开了一种洛克沙胂半抗原改造、修饰及人工抗原制备的方法；S1、选取实验耗材；S2、半抗原的改造，制备化合物A；S3、制备化合物B；S4、洛克沙胂以下简写为ROX人工抗原的合成；S5、人工抗原鉴定与多克隆抗体制备；S6、间接ELISA方法的建立；本发明以4‑羟基苯胂酸作为半抗原修饰物，在第3位和第4位上分别引入硝基和羧基，合成了与ROX结构相似的衍生物，并采用碳二亚胺法将ROX衍生物与牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OA偶联，成功制备了ROX的人工抗原，经生物质谱鉴定，ROX衍生物‑BSA、ROX衍生物‑OA的偶联比分别为4.2:1、12.6:1，免疫新西兰白兔获得的多克隆抗体最大效价可达1.28×105，对ROX的IC50为41.08ngmL，该抗体特异性较强。

主权项：1.一种洛克沙胂人工抗原的制备方法，其特征在于：包括有以下步骤：S1、选取实验耗材：4-羟基苯胂酸，牛血清白蛋白、卵清白蛋白、弗氏佐剂、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、N，N-二甲基甲酰胺、1-乙基碳二亚胺、薄层硅胶板；96孔可拆酶标板，其他化学制剂均为AR或GR；S2、半抗原的改造，制备化合物A：将4-羟基苯胂酸2.9-3.4g溶于20mL蒸馏水中，加入KOH0.8-1.2g，在95-100℃的油浴的条件下搅拌1.5-2.5h，加入氯乙酸1.7-2.2mg，继续搅拌5-8h，在室温条件下搅拌40-50h，采用薄层色谱法跟踪反应进程，加0.8-2molL的HCl调pH＝1.8-2.4，静置析出固体，抽滤得化合物A；S3、制备化合物B：称取化合物A溶于10mL浓硫酸中，加入0.09-0.4gKNO3进行反应，采用薄层色谱法跟踪反应完成后，加蒸馏水静置待淡黄色固体析出，抽滤得化合物B，即改造半抗原；S4、洛克沙胂人工抗原的合成：称取改造半抗原80.23-85mg，分别加入2-6mLDMF、120-160mgEDC充分溶解，活化5-7h，将40-60mgBSA溶于少量PBS缓冲液中，加入420-440μL活化液，2-6℃低速搅拌过夜，用生理盐水透析纯化5d，换液13-17次，即得洛克沙胂-牛血清白蛋白，用作免疫原，以同种方法将BSA换成OA，即得洛克沙胂-卵清蛋白，用作包被原。

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