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申请/专利权人：苏中药业集团股份有限公司

摘要：本发明公开了瞬时受体电位阳离子通道，亚族V，成员3TransientReceptorPotentialcationchannel,subfamilyV,member3,TRPV3在银屑病中的病理生理作用，可用于研制预防或治疗银屑病的药物。本发明还公开了野黄芩素作为一种TRPV3的抑制剂，在制备预防或治疗银屑病的药物中的应用。将含有根据本发明发现的或本发明提供的TRPV3抑制剂的药物用于预防或治疗银屑病时能够获得良好的预防或治疗效果。

主权项：1.野黄芩素、其在药学上可接受的盐作为唯一活性成分在制备预防或治疗银屑病皮损的药物中的应用，所述野黄芩素具有式（1）结构:式（1），所述药物为皮下注射剂、皮内注射剂、喷雾剂、粉雾剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂中的一种或几种。

全文数据：瞬时受体电位阳离子通道TRPV3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用技术领域本发明涉及医药领域，具体地，涉及TRPV3抑制剂在预防或治疗银屑病的药物的应用以及野黄芩素作为TRPV3的抑制剂在治疗银屑病及其TRPV3功能增强表达增加而引起的相关疾病药物中的应用。背景技术银屑病是一种常见的红斑鳞屑性皮肤炎症疾病，困扰着全世界2-3％的人群。根据临床特征，可将银屑病分为寻常型、关节型、脓疱型和红皮病型，而90％以上的银屑病属于寻常型。银屑病可出现于全身多个部位，典型的特征为表面附着银白色鳞屑的红色丘疹斑块。由于其病程较长，易复发，难根治，而且常造成患者外观损害，所以对患者的身体健康和精神状况均有较大影响。根据《中国银屑病治疗指南2008版》，银屑病的治疗目的为控制病情，减轻症状，避免复发，提高患者生活质量。对于银屑病的治疗，他扎罗汀维A酸类、中效与强效糖皮质激素、卡泊三醇作为局部治疗的一线外用药物；根据银屑病类型，可联合光化学疗法，包括UVA、PUVA、宽谱UVB和窄谱UVB；同时内服抗感染药物、甲氨蝶呤、环孢素或生物制剂依那西普等，同时配合心理治疗。尽管目前的治疗方式多种多样，但是其中不乏产生不良反应的药物或治疗方式。比如为追求疗效而滥用糖皮质激素可能导致停药后皮损加重的现象，而且长期外用糖皮质激素会导致皮肤萎缩，屏障功能损伤等；长期光化学疗法容易导致皮肤老化、色素沉着和皮肤癌；环孢素类内服药物的主要不良反应是肾毒性，而维A酸类内服药物可能导致患者的骨质出现变化。因此，发现新颖的治疗银屑病的作用靶点并针对这一新靶点开发一种能够缓解病情，可以长期使用而不产生副作用的新型药物具有十分重要的意义。目前，对银屑病的认识是一种自身免疫性炎症疾病，由各种炎症因子引起的角质细胞异常增生在疾病发展中起到关键作用。皮肤角质细胞不仅是炎症的应答者，也是炎症的加速者。而在皮肤角质细胞上广泛分布的多种离子通道参与着表皮分化与增殖，皮肤再生和免疫应答。瞬时受体电位阳离子通道TransientReceptorPotentialcationchannel,TRP是位于细胞膜上的一类重要的非选择性阳离子通道超家族，在人体各个器官的几乎所有细胞中均有表达。TRP通道分为6个亚家族：TRPCCannonical,TRPC1-7，TRPVVanilloid,TRPV1-6，TRPMMelastatin,TRPM1-8，TRPPPolycystin,TRPP2,TRPP3,TRPP5，TRPMLMucolipin,TRPML1-3和TRPAAnkyrin,TRPA1。这些通道涉及的功能包括视觉，听觉，嗅觉，味觉和躯体感觉比如痛觉，机械性刺激，温度感受等。其中，温度敏感型瞬时受体电位通道包括TRPV1，TRPV2，TRPV3，TRPV4，TRPM8和TRPA1，在皮肤上表达于皮肤感觉神经元，用于感知外界温度的变化，而TRPV1，TRPV3则在角质形成细胞表达较高，有可能和皮肤炎症以及皮肤屏障的形成相关。瞬时受体电位阳离子通道，亚族V，成员3TransientReceptorPotentialcationchannel,subfamilyV,member3,TRPV3与首先鉴定的TRPV1有着43％的序列相似性。但是，TRPV3在感觉型背根神经节sensoryDorsalRootGanglia,DRG和三叉神经节TrigeminalGanglia,TG中表达较低，相反在皮肤中表达最为丰富，特别是在表皮和发囊角质细胞中。但由于缺乏特异性的激动剂以及特异性的抑制剂，TRPV3的生理功能研究较少。发明内容本发明针对现有技术不足，提供了以TRPV3为靶点筛选预防或治疗银屑病的药物的应用。为了实现上述目的，本发明提供了TRPV3作为用于预防或治疗银屑病的药物靶点的证据，本发明研究表明皮肤炎症中TRPV3的表达升高和或活性增强，TRPV3活化导致皮肤角质细胞过度增殖并释放促炎症因子。本发明具体技术方案如下：瞬时受体电位阳离子通道TRPV3在研制预防或治疗银屑病的药物中的应用。上述应用以TRPV3作为药物靶点，考察药物降低TRPV3在皮肤炎症中的表达和或活性。进一步的，所述药物为TRPV3抑制剂。所述TRPV3抑制剂包括可逆性、不可逆性、竞争性、非竞争性或反竞争性抑制剂或通道阻断剂。进一步的，可利用过表达TRPV3的细胞系筛选并验证所述药物。优选的，所述的过表达TRPV3的细胞系包括经质粒转染或病毒感染得到的稳定表达TRPV3的工具细胞。本发明提供了筛选及鉴定TRPV3抑制剂的高通量筛选方法，利用过表达TRPV3的细胞系利用特异性结合于钙的荧光探针筛选并鉴定对2-氨基乙氧基联苯硼酸盐2-APB诱导的细胞内钙增加有抑制的药物。本发明的另一目的在于提供野黄芩素及其立体异构体、其在药学上可接受的盐和或溶剂化物在制备瞬时受体电位阳离子通道TRPV3抑制剂中的应用，所述野黄芩素具有式1结构。上述瞬时受体电位阳离子通道TRPV3抑制剂为预防或治疗由于TRPV3功能增强表达增加而引起的相关疾病。优选的，所述疾病为银屑病。本发明所述的疾病为银屑病，包括寻常型银屑病、脓疱型银屑病、红皮病型银屑病中的一种或几种。在本发明所述野黄芩素的制备方法没有特别的限定，本领域技术人员可以根据本领域内的公知常识制备本发明所述的野黄芩素，或者通过市售获得本发明所述的野黄芩素。在优选情况下，本发明所述的野黄芩素可以根据文献QianLH,LiNG,TangYP,etal.SynthesisandBio-ActivityEvaluationofScutellareinasaPotentAgentfortheTherapyofIschemicCerebrovascularDisease[J].InternationalJournalofMolecularSciences,2011,1211:8208-16.中提供的方法制备得到。本发明所述野黄芩素的立体异构体没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，例如可以是野黄芩素的对映异构体或非对映异构体。另外，本发明对所述在药学上可接受的盐也没有特别的限定，可以为本领域的常规选择。进一步的，本发明对所述溶剂化物也没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，在优选情况下，所述溶剂化物包括将野黄芩素溶于二甲基亚砜、吐温80、生理盐水、盐酸和乙醇中的一种或多种，优选为二甲基亚砜、吐温80或生理盐水。进一步的，上述瞬时受体电位阳离子通道TRPV3抑制剂还包括药学上可接受的载体。所述述TRPV3抑制剂的剂型没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，只要其可以实现便于使用且可以获得较好的治疗效果的目的即可。在优选的情况下，所述药物可以皮下注射剂、皮内注射剂、喷雾剂、粉雾剂、外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂中的一种或几种，进一步优选为皮下注射剂或软膏剂。当所述药物以上述剂型的形式被使用时，该药物还可以包括赋形剂、稳定化剂、保存剂、缓冲剂、助溶剂、乳化剂、稀释剂或等渗剂。在本发明中对上述皮下注射剂、皮内注射剂、喷雾剂、粉雾剂、外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂的制备方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员所公知的方法，在此不再赘述。在本发明中，对所述TRPV3抑制剂中野黄芩素的含量没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，只要能够获得良好的治疗效果即可，例如，所述野黄芩素的质量百分含量可以为0.1-5％。本发明优点：1本发明将瞬时受体电位阳离子通道TRPV3作为预防或治疗银屑病的药物靶点，为预防或治疗银屑病提供新的思路。2利用本发明所述的过表达TRPV3细胞系能够方便地筛选并鉴定TRPV3抑制剂，具有很高的准确性。3本发明研究发现野黄芩素及其立体异构体、其在药学上可接受的盐和或溶剂化物能够有效抑制瞬时受体电位阳离子通道TRPV3，对银屑病具有很好的预防或治疗效果。给药方便，药物副作用小，毒性低，生物利用度高。进一步地，从本发明提供的研究结果可以看出:在5％咪喹莫特Imiquimod,IMQ诱导的小鼠银屑病皮损中TRPV3表达增高，而活化TRPV3能够促进人永生化角质细胞系HaCaT的增殖及促炎症因子表达；利用脂质体转染得到的过表达TRPV3的HEK-293细胞系能够应答2-APB，而筛选得到的野黄芩素对2-APB诱导的钙内流及其电流具有明显的抑制作用。野黄芩素能够抑制TRPV3活化所导致的HaCaT细胞过度增殖和促炎症因子表达，并对5％IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损具有显著的缓解作用。综上所述，将本发明所述的以TRPV3为靶点发现用于制备预防或治疗银屑病的药物具有很好的开发前景。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分的予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：图1A为本发明提供的实施方式中典型的由5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处外观；图1B为5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损PASI评分；图1C为典型的由5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处的病理变化；图1D为5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处表皮厚度统计。图2A为本发明提供的优选实施方式中5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处TRPV3的蛋白表达；图2B为5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处TRPV3的蛋白水平定量图；图2C为在5％IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处TRPV3的mRNA转录水平。图3A为在本发明提供的实施例中HaCaT细胞中TRPV3的蛋白表达；图3B为在HaCaT细胞上300μM2-APB诱导的TRPV3电流；图3C为在HaCaT细胞上典型的TRPV3电流-电压曲线。图4A为在本发明提供的实施例中TRPV3功能上调增加HaCaT细胞的增殖能力；图4B为TRPV3功能上调增加HaCaT细胞中白介素-6Interleukin-6,IL-6mRNA转录水平；图4C为TRPV3功能上调增加HaCaT细胞中白介素-8Interleukin-8,IL-8mRNA转录水平。图5A为在本发明提供的实施例中2-APB在表达TRPV3的HEK-293细胞上诱导的电流，内置图为典型的TRPV3电流-电压关系；图5B为2-APB激动mTRPV3通道的量效关系。图6A，利用细胞内钙荧光成像高通量筛选方法发现野黄芩素能够在稳定转染TRPV3的HEK-293细胞上抑制2-APB诱导的钙内流；图6B为不同浓度的野黄芩素在稳定转染mTRPV3通道的HEK-293细胞上抑制2-APB诱导的电流；图6C为野黄芩素对2-APB诱导的mTRPV3电流的抑制作用的量效关系。图7A为在本发明提供的实施例中野黄芩素对TRPV3激动剂引起的HaCaT增殖的影响；图7B为在本发明的一种实施例中野黄芩素对HaCaT中IL-6转录水平的影响；图7C为野黄芩素对HaCaT中IL-8转录水平的影响。图8A为本发明提供的优选实施方式中野黄芩素对IMQ诱导的小鼠银屑病模型外观的影响；图8B为野黄芩素对小鼠银屑病模型诱导进程的影响。图8C为在本发明的一种实施例中野黄芩素对IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处病理变化的影响；图8D为野黄芩素对IMQ诱导的小鼠银屑病模型皮损处表皮厚度的影响。具体实施方式以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明提供了以TRPV3为靶点研制预防或治疗银屑病药物的应用，包括寻常型银屑病、脓疱型银屑病、红皮病型银屑病中的一种或几种。本发明还提供了野黄芩素作为一种TRPV3的抑制剂，在制备预防或治疗银屑病的药物中的应用。将含有根据本发明发现的或本发明提供的TRPV3抑制剂的药物用于预防或治疗银屑病时能够获得良好的预防或治疗效果，所述野黄芩素为式1所示的化合物。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，在没有特别说明的情况下，所使用的各种试剂和材料均来自市售。在以下优选实施方式中，使用5％咪喹莫特Imiquimod,IMQ连续涂抹诱导的小鼠银屑病模型评价药物对银屑病的作用。IMQ诱导的银屑病模型是目前应用最为广泛的评价药物对银屑病进程的影响的模型。在以下优选实施方式中，使用银屑病区域和严重性指数PsoriasisAreaandSeverityIndex,PASI评分标准对小鼠银屑病模型进行评价。PASI评分是临床试验中常用的评价银屑病严重程度的方法。在以下优选实施方式中，使用苏木精-伊红hematoxylin-eosin,HE染色法对小鼠皮肤石蜡切片进行染色，并进行病理学检查。在以下优选实施方式中，所使用的实验C57BL6小鼠均购自扬州大学比较医学中心，雌雄各半，体重18-20g，鼠龄6-8周。在以下实施例中，使用人永生化角质细胞系HaCaT作为体外模型评价药物对皮肤胶质细胞功能的影响。HaCaT在实验中很好的表现出人角质细胞的特性，是广为认可的细胞模型。在以下实施例中，通过MTT实验反映药物对细胞增殖的影响。在以下实施例中，通过实时定量PCR实验反映药物对细胞或组织中特定基因的转录水平的影响。在以下实施例中，编码TRPV3通道的质粒通过脂质体转染，在HEK-293细胞系中稳定表达TRPV3通道。在以下实施例中，TRPV3抑制剂是在稳定表达TRPV3的HEK-293细胞吧上通过高通量检测药物对细胞内钙增加的抑制而发现，药物对TRPV3通道的作用进一步利用膜片钳放大系统HEKA公司进行检测的。在以下实施例中，所使用的野黄芩素根据文献文景兵,张庆文,殷志琦,等.木蝴蝶种子中黄酮类化学成分研究[J].中国药学杂志,2011,463:170-173.中提供的方法制备得到。实施例1本实施例用于说明本发明提供以TRPV3为靶点筛选预防或治疗银屑病药物的应用。1咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型购自扬州大学比较医学中心的16只C57BL6小鼠，雌雄各半，体重18-20g。剃除小鼠背毛，用记号笔在背部皮肤上画出2×1.5cm的造模区域。将小鼠按雌雄，分别随机分成2组每组8只。实验前将小鼠放置在安静、避强光的环境中饲养3天以适应环境，光照与黑暗时间比为1:1，室温控制在25℃，湿度55％，小鼠能够自由进食和饮水。将62.5mg5％0.1g:2g咪喹莫特软膏珠海联邦制药股份有限公司连续涂抹于小鼠背部皮肤6天诱导银屑病样皮损，对照组给予同等剂量的凡士林软膏。于造模第1，3，5天，对小鼠背部皮肤进行拍照记录，造模第5天皮肤外观如图1A所示。2小鼠银屑病模型临床症状评价小鼠银屑病模型的临床症状采用PASI评分标准，从红斑、鳞屑和浸润增厚3项指标进行评价，以0～4分进行记分，将3个指标的积分相加得到总积分。PASI评分标准如下：0分，无症状；1分，轻度；2分，中度；3分，重度；4分，极重度。每天于涂抹IMQ软膏之前进行PASI评价。结果如图1B和表1所示，注：计量资料以均数±标准差mean±SD表示，使用单因素方差分析检测，分析结果中，**P中国药科大学瞬时受体电位阳离子通道TRPV3在研制预防或治疗银屑病药物中的应用6SIPOSequenceListing1.0120DNA人工序列ArtificialSequence1cggtcaccaagacctctcca20220DNA人工序列ArtificialSequence2cgctcggactgttgggattg20319DNA人工序列ArtificialSequence3gtgtgaaagcagcaaagag19419DNA人工序列ArtificialSequence4ctccaaaagaccagtgatg19520DNA人工序列ArtificialSequence5gtccttgttccactgtgcct20620DNA人工序列ArtificialSequence6gcttccacatgtcctcacaa20

权利要求：1.瞬时受体电位阳离子通道TRPV3在研制预防或治疗银屑病的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于以TRPV3作为药物靶点，考察药物降低TRPV3在皮肤炎症中的表达和或活性。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为TRPV3抑制剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述TRPV3抑制剂包括可逆性、不可逆性、竞争性、非竞争性或反竞争性抑制剂或通道阻断剂。5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于利用过表达TRPV3的细胞系筛选并验证所述药物。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的过表达TRPV3的细胞系包括经质粒转染或病毒感染得到的稳定表达TRPV3的工具细胞。7.野黄芩素及其立体异构体、其在药学上可接受的盐和或溶剂化物在制备瞬时受体电位阳离子通道TRPV3抑制剂中的应用，所述野黄芩素具有式1结构:8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述瞬时受体电位阳离子通道TRPV3抑制剂为预防或治疗由于TRPV3功能增强表达增加而引起的相关疾病。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述疾病为银屑病。10.根据权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于所述瞬时受体电位阳离子通道TRPV3抑制剂还包括药学上可接受的载体。

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