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申请/专利权人：遵义医科大学附属医院

摘要：本方案公开了疫苗技术领域，特别涉及一种淋病奈瑟菌联合疫苗，联合疫苗由纯化后的NGO2105Passenger、NHBA、MetQ三种蛋白与CTB佐剂混合成免疫体系并通过鼻腔对小鼠进行免疫。ELISA测定各免疫组小鼠血清及阴道分泌物中抗体效价，证明联合蛋白疫苗较单蛋白疫苗有较强的免疫原性；通过抗体粘附抑制细胞、血清杀菌力实验、血清抗体亚型检测以及脾细胞因子检测，证明联合疫苗具有较强的抗体功能活性与免疫应答反应性；通过小鼠感染淋病奈瑟菌模型，证明联合疫苗加速淋病奈瑟菌感染的清除效果较单蛋白疫苗强。本专利为后续淋病奈瑟菌联合疫苗制备与开发及其临床应用提供前期实验基础。

主权项：1.一种淋病奈瑟菌联合疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、以淋病奈瑟菌FA1090标准菌株的基因组DNA为模板，使用上游引物和下游引物，通过PCR扩增NGO2105蛋白的Passenger结构域序列、NGO1958基因的全长序列及NGO2139基因的截短序列，得到对应的PCR扩增产物Passenger、NHBA及MetQ；步骤二、将PCR扩增产物与表达载体pColdTF质粒定向重组，构建重组质粒pColdTF-Passenger、pColdTF-NHBA及pColdTF-MetQ；使用HindIII和XbaI对重组质粒进行双酶切验证，酶切产物经电泳鉴定可见与目的基因大小相符的酶切片段，核酸序列测序结果分别与GenBank数据库中淋病奈瑟菌FA1090标准菌株NGO2105蛋白的Passenger结构域序列、NGO1958基因的全长序列及NGO2139基因的的截短序列相符；基因片段的扩增引物如下表所示： 上表中，下划线部分分别是HindIII和XbaI的内切酶部分；步骤三、将重组质粒pColdTF-Passenger、pColdTF-NHBA及pColdTF-MetQ转入E.coliBL21表达菌株中；获得pColdTF-Passenger-E.coliBL21、pColdTF-NHBA-E.coliBL21以及pColdTF-MetQ-E.coliBL21蛋白表达菌株；步骤四、将pColdTF-Passenger-E.coliBL21、pColdTF-NHBA-E.coliBL21以及pColdTF-MetQ-E.coliBL21蛋白表达菌株增菌培养至吸光度A600nm为0.6～0.8后加入终浓度为0.05～2mmolL的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导，15℃，90～120rpm诱导10～12h，收集菌体超声破菌，上清液经Ni-NTA亲和层析柱纯化，得到纯化后的NGO2105Passenger、NHBANGO1958以及MetQNGO2139三种蛋白；步骤五、将纯化后的三种蛋白混合均匀得到联合蛋白，将联合蛋白与CTB疫苗佐剂充分混匀，得到淋病奈瑟菌联合疫苗。

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