申请/专利权人：上海市东方医院(同济大学附属东方医院)

申请日：2021-10-21

公开（公告）日：2024-04-26

公开（公告）号：CN113832548B

主分类号：C40B50/06

分类号：C40B50/06;C40B40/02;C12N5/0775;A01N1/02

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.26#授权;2022.01.11#实质审查的生效;2021.12.24#公开

摘要：本发明涉及一种临床级人脐带间充质干细胞资源库多级库的构建方法，属于细胞培养技术领域。本发明所述构建方法进行原料预处理、干细胞分离和扩增培养获得种子库，然后通过接种密度、培养时间等条件的设置实现主库、工作库和产品库的构建。本发明所述构建方法细胞活率高、质量可控，能够成功构建临床级四级干细胞资源库，即为种子库、主库、工作库和产品库。

主权项：1.一种临床级人脐带间充质干细胞资源库多级库的构建方法，所述多级库包括种子库、主库、工作库和产品库；所述构建方法包括以下步骤：将脐带剖开，清洗，去除血管，在第一冲洗液和第二冲洗液中依次浸泡，得到预处理的脐带；所述第一冲洗液包括体积百分含量为80％的无血清培养基和体积百分含量为20％的青链霉素混合液；所述第二冲洗液包括体积百分含量为90％的无血清培养基和体积百分含量为10％的青链霉素混合液；将预处理的脐带切成1～2mm3的组织块，置于6孔板中，在二氧化碳培养箱中贴壁培养20min，加入无血清培养基进行培养，待细胞融合率达到80～90％后，消化，得到原代细胞；将原代细胞按照0.8～1万cm2的接种密度接种到6孔板，加入无血清培养基，培养3～4d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P0代细胞；得到P0代细胞和得到P1代细胞前，还包括对上清进行内毒素、支原体、厌氧菌和需氧菌的检测；将P0代细胞按照0.8～1万cm2的接种密度接种至培养瓶中，加入无血清培养基进行培养3～4d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P1代细胞；将P1代细胞按照0.8～1万cm2的接种密度接种到培养瓶中，加入无血清培养基进行培养2～3d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P2代细胞；将P2代细胞重悬于冻存液，冻存，构建得到种子库；将P2代细胞按照0.5～0.8万cm2的接种密度接种到培养瓶中，加入无血清培养基进行培养3～4d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P3代细胞；将P3代细胞重悬于冻存液，冻存，构建得到主库；将P3代细胞按照0.5～0.8万cm2的接种密度接种到培养瓶中，加入无血清培养基进行培养3～4d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P4代细胞；将P4代细胞重悬于冻存液，冻存，构建得到工作库；将P4代细胞按照0.5～0.8万cm2的接种密度接种到细胞工厂中，加入无血清培养基进行培养4～5d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P5代细胞；将P5代细胞重悬于冻存液，冻存，构建得到产品库；得到P2代细胞、P3代细胞、P4代细胞和P5代细胞前，还包括对上清进行内毒素、支原体、厌氧菌和需氧菌的检测，以及对细胞进行活率检测、流式检测和传染病核酸检测；所述流式检测包括对CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR、CD11b和CD19进行检测；所述传染病核酸检测的指标包括新型冠状病毒核酸、乙型肝炎病毒核酸、丙型肝炎病毒核酸、梅毒螺旋体抗体和人类免疫缺陷病毒核酸；所述冻存的条件为：4℃保持15min，1℃min降至-7℃，60℃min降至-60℃，30℃min升至-30℃，1℃min降至-90℃。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 上海市东方医院(同济大学附属东方医院) 一种临床级人脐带间充质干细胞资源库多级库的构建方法

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