申请/专利权人：中山大学中山眼科中心

申请日：2023-11-23

公开（公告）日：2024-05-03

公开（公告）号：CN117286229B

主分类号：C12Q1/6858

分类号：C12Q1/6858;C12Q1/6806;C12Q1/686;C12Q1/6869

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.03#授权;2024.01.12#实质审查的生效;2023.12.26#公开

摘要：本发明公开了一种MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法。该方法结合MHC 区域靶向捕获和PacBio平台的长读长染色质邻近连接测序技术，采用混合酶解的方式：第一步采用蛋白酶K酶解，第二步采用链霉素蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解方案。该方法能够有效促进DNA解交联，减少肽段的残留，进而提高PCR扩增后的产量，改善MHC区域的三维基因组捕获效率，并利用长读长测序优势，实现对MHC区域三维结构的高通量的捕获测序。

主权项：1.一种非疾病诊断和治疗目的的MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）细胞甲醛固定和交联：将细胞利用甲醛溶液进行交联固定，得到交联固定后的细胞；（2）细胞裂解和DNA片段连接：将步骤（1）中得到的交联固定后的细胞经裂解后，收集细胞核颗粒；然后利用限制性内切酶DpnII进行酶切反应，得到酶切产物；再将酶切产物利用T4DNA连接酶进行连接，得到DNA连接产物；（3）混合酶解：①在步骤（2）得到的DNA连接产物中加入十二烷基硫酸钠溶液和蛋白酶K，然后在56～63℃孵育4～12h使染色质解交联，再加入NaCl溶液淬灭反应；待反应结束后加入由苯酚、氯仿和异戊醇组成的混合溶剂，混合均匀后加入GlycoBlue核酸共沉淀剂、醋酸钠溶液和异丙醇，在-80±5℃条件下孵育后离心、取沉淀，冰乙醇溶液清洗后用EB缓冲液重悬，得到DNA重悬液；②在步骤①得到的DNA重悬液中加入复合酶溶液，30～37℃孵育4～12h，然后加入由苯酚、氯仿和异戊醇组成的混合溶剂，混合均匀，再加入GlycoBlue核酸共沉淀剂、醋酸钠溶液和异丙醇，在-80±5℃条件下孵育后离心、取沉淀，冰乙醇溶液清洗后用EB缓冲液重悬，得到待测DNA样本；其中，复合酶为链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和胰蛋白酶；（4）MHC基因杂交捕获与PCR扩增：将步骤（3）②中得到的待测DNA样本使用MHC区域靶向探针进行杂交捕获，再进行PCR扩增，得到PCR产物；（5）PacbioHiFiCCS文库构建和测序：将步骤（4）中得到的PCR产物构建SMRTbell文库并进行PacBio长片段测序；步骤①中所述的蛋白酶K的用量为按其在孵育体系的终浓度为1mgml添加计算；步骤②中所述的复合酶溶液中链霉蛋白酶的浓度为1000 μgmL，嗜热菌蛋白酶的浓度为500 μgmL，胰蛋白酶的浓度为 500 μgmL。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中山大学中山眼科中心 一种MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法

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