申请/专利权人：浙江科技学院

申请日：2021-10-11

公开（公告）日：2024-05-24

公开（公告）号：CN114045290B

主分类号：C12N15/12

分类号：C12N15/12;A01K67/0278;C12N15/85;C12N15/89

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.24#授权;2022.03.04#实质审查的生效;2022.02.15#公开

摘要：本发明公开了一种角朊蛋白基因修饰小鼠动物模型的构建方法和应用。在角朊蛋白基因hornerin的第三外显子中插入荧光蛋白编码基因Tdtomato和终止子序列WPRE，使得hornerin基因不表达主要蛋白功能单元而表达Tdtomato，达到hornerin基因功能缺失的效果。本发明按照独特的方法构建成功KO小鼠动物模型，实现了生物工具的制备，具有很好的应用价值，可用于发病机制及药物的筛选。

主权项：1.一种制备角朊蛋白hornerin基因修饰动物模型的方法，其特征在于，所述方法是hornerin基因中的第三外显子中插入荧光蛋白编码基因Tdtomato和终止子序列WPRE，使得hornerin基因不表达主要蛋白功能单元，而表达Tdtomato，达到hornerin基因功能缺失的效果；方法包括以下步骤：C1，制备获得sgRNA载体；C2，采用sgRNA载体进行体外转录，转录产物与Cas9CRISPR的RNA混合，得到进行显微注射的RNA混合液；C3，制备获得带有荧光蛋白编码基因Tdtomato和终止子序列WPRE的打靶载体；C4，将打靶载体和RNA混合液通过显微注射到小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体的输卵管中发育，产出小鼠，获得F0代小鼠；C5，利用PCR技术对F0代小鼠进行检测，验证细胞中hornerin基因第三外显子靶位点区插入的荧光蛋白编码基因Tdtomato和终止子序列WPRE，获得hornerin基因修饰阳性小鼠；C6，将上述获得的hornerin基因修饰阳性小鼠通过自交和杂交的方式繁殖，扩大种群数量，并用PCR技术进行检测，筛选并建立稳定的hornerin--纯合子小鼠；所述C3中的靶向载体，包括：SEQIDNO：5的sgRNA靶序列作为hornerin基因靶位点区域序列；期望的供体DNA序列，包含荧光蛋白编码基因Tdtomato和终止子序列WPRE；与sgRNA靶序列5’端同源的DNA片段LR；与sgRNA靶序列3’端同源的第二个DNA片段RR。

全文数据：

权利要求：

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