申请/专利权人：深圳市睿法生物科技有限公司

申请日：2021-03-02

公开（公告）日：2024-06-04

公开（公告）号：CN112941147B

主分类号：C12Q1/6806

分类号：C12Q1/6806;C40B50/06;C40B40/06

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.04#授权;2021.07.02#实质审查的生效;2021.06.11#公开

摘要：一种高保真靶标基因建库方法及其试剂盒，该方法包括磷酸化步骤，在模板分子的5’端修饰磷酸基团；退火延伸步骤，使用第一引物退火、延伸，得到靶核苷酸分子；第一测序接头连接步骤，将第一测序接头连接至靶核苷酸分子，获得第一测序接头连接产物；酶切步骤，切断第一引物，得到第一测序接头连接产物；双链末端修平步骤，切除单链序列，得到平末端第一测序接头连接产物；第二测序接头连接步骤，将第二测序接头连接至平末端第一测序接头连接产物，得到第二测序接头连接产物；扩增步骤，用第二引物、第三引物扩增第二测序接头连接产物，得到文库。本发明将常规的建库和捕获分开的步骤整合为一个流程，有效简化流程，减少操作过程中DNA的损失。

主权项：1.一种高保真靶标基因建库方法，其特征在于，由以下步骤组成：磷酸化步骤，包括在模板分子的5’端修饰磷酸基团；退火延伸步骤，包括将第一引物退火于模板分子的靶核苷酸区域并延伸，得到含有靶核苷酸延伸链的双链分子，即靶核苷酸分子，所述第一引物含有酶切位点、串联至所述酶切位点3’端且可与模板分子上的靶核苷酸序列互补配对的第一序列、串联至所述酶切位点5’端且不与模板分子上的核苷酸序列互补配对的第二序列；第一测序接头连接步骤，包括将第一测序接头连接至所述靶核苷酸分子，获得第一测序接头连接产物；磁珠结合步骤，包括使用包被有链霉亲和素的磁珠收集所述第一测序接头连接产物；酶切步骤，包括使用酶切断第一测序接头连接产物上具有酶切位点的第一引物，然后去除第一引物中的酶切位点5’端的核苷酸序列，得到切除了第一引物部分序列后的第一测序接头连接产物；双链末端修平步骤，包括切除第一测序接头连接产物中原始模板链3’端突出的单链序列，得到平末端第一测序接头连接产物；第二测序接头连接步骤，包括将第二测序接头连接至平末端第一测序接头连接产物，得到第二测序接头连接产物；扩增步骤，包括使用第二引物、第三引物扩增第二测序接头连接产物，得到测序文库；其中，所述第二引物含有从3’端到5’端依次串联的内接头、第一样本标签、外接头，所述内接头可与第一测序接头的反向链互补配对；所述第三引物含有或不含有第二样本标签；所述第三引物不含有第二样本标签时，所述第三引物含有从3’端到5’端依次串联的内接头、外接头，所述内接头可与所述第二测序接头的反向链互补配对；所述第三引物含有第二样本标签时，所述第三引物含有从3’端到5’端依次串联的内接头、第二样本标签、外接头，所述内接头可与所述第二测序接头的反向链互补配对；所述第一测序接头含有互补配对的正向链、反向链，所述正向链的5’端串联有第一分子标签，所述反向链的3’端串联有与所述第一分子标签互补配对的核苷酸序列，所述第一分子标签的5’端修饰有磷酸基团；所述第二测序接头含有或不含有第二分子标签，所述第二测序接头含有可互补配对的正向链、反向链；所述第二测序接头不含有第二分子标签时，所述第二测序接头的反向链的5’端修饰有磷酸基团；所述第二测序接头含有第二分子标签时，所述第二测序接头的反向链的5’端串联有第二分子标签，第二分子标签的5’端修饰有磷酸基团，所述第二测序接头的正向链的3’端串联有可与所述第二分子标签互补配对的核苷酸序列。

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