申请/专利权人：浙江省血液中心

申请日：2022-09-08

公开（公告）日：2024-06-04

公开（公告）号：CN116143941B

主分类号：C07K19/00

分类号：C07K19/00;C12N15/85;G01N33/543;G01N33/68;G01N33/58

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.04#授权;2023.06.09#实质审查的生效;2023.05.23#公开

摘要：本发明提供一种KIR3DL1‑IgG‑Fc融合重组蛋白、应用及试剂盒，并联合液相芯片技术平台实现了KIR3DL1与配基HLA‑I类分子相互作用的检测。本发明通过体外构建并获得KIR3DL1分子胞外结构域与人IgG‑Fc融合重组蛋白，再与商品化的偶联97种HLA‑I类分子的Luminex磁珠反应，通过Lumiex荧光仪检测KIR3DL1‑IgG‑Fc融合重组蛋白与不同磁珠反应的荧光值，从而判断3DL1分子与不同HLA分子表达的配基相互作用强度，实现了KIR与HLA分子高通量、高灵敏性和快速检测。KIR与HLA相互作用研究是免疫移植领域的热点和难点问题之一，本发明提供了KIR3DL1与配基HLA相互作用的快速检测的方案，这对今后选择和分析判断合适的造血干细胞供者具有重要的参考价值。

主权项：1.一种KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白，其特征在于：所述KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白由如下方式得到：S101、根据KIR3DL1基因序列特点，设计并合成KIR3DL1胞外结构域（D0、D1、D2）和stem区域序列特异性扩增引物；S102、制备人基因组RNA，并逆转录为cDNA；S103、将步骤S101合成的引物扩增步骤S102获得的cDNA，获取KIR3DL1胞外结构域（D0、D1、D2）和stem区域扩增片段；S104、将步骤S103获得的目的片段与TOPOTA载体连接，并转化大肠杆菌；S105、挑取步骤S104获得的大肠杆菌单克隆，抽提质粒并测序筛选连接正确的TA重组质粒；S106、将步骤S105获得的重组质粒和真核表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2进行双酶切；S107、将步骤S106双酶切获得的KIR3DL1胞外-stem区域片段和pFUSE-hIgG1-Fc2载体连接反应并转化大肠杆菌；S108、挑取步骤S107获得的大肠杆菌单克隆培养，抽提质粒并测序筛选连接正确的pFUSE-hIgG1-Fc2-KIR3DL1重组质粒；S109、将步骤S108获得的重组质粒转染人胚胎肾细胞（HEK293）；S110、提取步骤S109转染细胞表达的KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白；所述步骤S101中，扩增KIR3DL1胞外结构域（D0、D1、D2）和stem区域序列（1-319个密码子）的特异性扩增引物：上游引物序列为：GAATTCGCACATGGGTGGTCAGGACA（5’-3’）；下游引物序列为：AGATCTGTGCAGGTGTCTGGGGTTA（5’-3’）；上游引物5’端设计EcoRI酶切位点（GAATTC）；下游引物5’端设计BglII酶切位点（AGATCT）。

全文数据：

权利要求：

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