申请/专利权人：南京农业大学

申请日：2021-04-06

公开（公告）日：2024-06-11

公开（公告）号：CN113215310B

主分类号：C12Q1/70

分类号：C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.11#授权;2021.08.24#实质审查的生效;2021.08.06#公开

摘要：本发明公开了一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法，属于分子检测技术领域。为了克服现有检测方法敏感性不够高的技术不足，本发明提供一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法。本发明利用提取试剂盒提取样品DNA后，通过设计特异性引物，利用普通PCR技术对CPV编码基因进行分片段扩增，然后对目标片段进行荧光定量PCR扩增检测，从而可以在DNA水平上检测和诊断犬细小病毒。该方法操作简单，结果直观，对于调查CPV的流行情况并针对性建立有效的疫病防控措施有重要意义。

主权项：1.一种通过荧光定量PCR非诊断目的快速检测犬细小病毒的方法，其包括如下步骤：1样品采集处理：利用TaKaRa生物技术有限公司的DNA提取试剂盒提取样品DNA；2PCR检测：将步骤1获得的DNA采用ABIGeneAmp®9700型PCR仪进行PCR扩增，扩增反应结束后取10μL的PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，通过全自动紫外凝胶成像分析系统进行结果检验，确定扩增获得产物是否与目标片段一致；其中PCR反应体系的体积为20μL，其组成包括FastPfu5×Buffer4μL，2.5mMdNTPs2μL，5μMForwardPrimer0.2μL，5μMReversePrimer0.2μL，FastPfuPolymerase0.4μL，TemplateDNA10ng，补加双蒸水至20μL；引物对ForwardPrimer和ReversePrimer包括CPV-P1FCPV-P1R、CPV-P2FCPV-P2R、CPV-P3FCPV-P3R、CPV-P4FCPV-P4R和CPV-P5FCPV-P5R5组引物对；其中CPV-P1F的核苷酸序列为ATTCTTTAGAACCAACTGAC，CPV-P1R的核苷酸序列为AATGCATCAAAAGTTTGTAC；CPV-P2F的核苷酸序列为TTATGGAGGGAGTAAATTGGT，CPV-P2R的核苷酸序列为CCTTACCTCTCCTGGCTCTCT；CPV-P3F的核苷酸序列为AGACACAAGCGGCAAGCAATC，CPV-P3R的核苷酸序列为GCTCTATTTGTTTGCCATGTATGTG；CPV-P4F的核苷酸序列为CAGGTGATGAATTTGCTACA，CPV-P4R的核苷酸序列为CATAGCGGTCTGGTTGATTAAGCA；CPV-P5F的核苷酸序列为CTATGCGGTCTGGTTGATTAAGC，CPV-P5R的核苷酸序列为AAGTATCAATCTGTCTTTAAGGGGGG；3荧光定量PCR扩增检测：将经过步骤2确定扩增产物与目标片段一致的DNA产物，使用全自动荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR扩增反应，实时监测相对荧光强度依据设定的判定标准确定样本中是否包含犬细小病毒；所述荧光定量PCR扩增检测包括如下步骤：配制荧光定量PCR扩增反应总体系，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR反应仪并设定PCR反应程序为：预变性阶段94℃：2分钟；PCR扩增阶段：94℃15秒，60℃30秒40个循环，扩增产生的荧光信号在AppliedBiosystems全自动荧光定量PCR仪上进行检测；所述的荧光定量PCR扩增反应总体系为20μL，包括如下体积的组分：正向引物1μL，反向引物1μL，荧光染料0.6μL，无引物水合缓冲液9.5μL，模板标准品1μL，分子级双蒸水6.9μL；其中正向引物的核苷酸序列为TGGTTATAGTGCACCATATTA，反向引物的核苷酸序列为AATGGTTTACAATACATTCTA。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 南京农业大学 一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法

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