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申请/专利权人：重庆医科大学

摘要：本发明涉及骨科移植物医用材料技术领域，采用冻融循环和脱氧核糖核酸酶消化的脱细胞方法获得Wnt信号激活的骨细胞脱细胞基质及其表衬的硬材料支架。该技术去除了所有细胞器和95％的DNA，保留胶原、糖胺多糖等细胞基质成分，获得的脱细胞基质保持了完整的细胞基膜，以及密集的椭圆形和蜂窝状结构。该脱细胞基质可以诱导应力纤维产生，利于细胞粘附、铺展、成骨分化和矿化；并增加BMSC中RANKL和MCSF、Vegfa和Angpt1以及Ngf的表达，植入后生成大量与宿主骨相似并整合良好的新骨和致密排列的I型胶原，诱导破骨细胞、血管和神经生成，实现骨缺损的快速修复，有望达到自体骨移植的效果，适合转化应用。

主权项：1.一种Wnt信号激活骨细胞脱细胞基质表衬的骨修复支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.3D打印PCL支架：打开3DBio-maker软件，根据程序设置打印PCL支架，将其修剪为5mm×5mm×1mm的规格；之后将支架放于75%酒精灭菌1h，无菌PBS浸洗5次，每次清洗3min，将支架放于超净台晾干，紫外照射支架正反面各20min灭菌；b.提取骨细胞Wnt激活小鼠的骨细胞：小鼠乙醚麻醉后脱颈处死，无菌条件下解剖取下双侧股骨、胫骨，去除软组织后取骨干，将骨干剪为1~2mm大小的碎片，加入1mgmLI型胶原酶溶液于37℃摇床消化15min，之后于冰上完全培养基中静置5min，此过程重复3次；I型胶原酶于37℃处理15min，4mMEDTA于37℃处理5min，交替处理3次，冲洗骨碎片后进行培养，每两天换液，待骨细胞长满培养皿70%使用并移走骨碎片继续培养；c.3D打印PCL支架上接种Wnt激活骨细胞：在支架上滴加10μL血清浸润支架并晾干；之后消化骨细胞并计数，配制成2×107mL的细胞悬液，每个支架接种10µL细胞悬液，将支架放入孵箱2h让细胞黏附，之后加入完全培养基进行培养，隔天换液；d.冻融循环和DNA酶脱细胞：培养14天后弃去培养基，无菌PBS浸洗2次；将支架转移至15mL离心管，加入5mL无菌PBS；进行冻融循环脱细胞处理，将离心管放入液氮中10min，之后放入37℃水浴锅10min，无菌PBS浸洗支架3次去除细胞碎片，每次清洗3min，加入0.2mgmL的DNA酶于37℃孵育1h；无菌PBS浸洗3次，每次清洗3min，置于4℃无菌PBS中保存；e．使用时，将c步骤制得的支架放于超净台晾干，紫外照射正反面各10min；所述完全培养基包括：10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素α-MEM。

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