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申请/专利权人：四川省畜牧科学研究院
申请日：2023-10-25
公开（公告）日：2024-06-14
公开（公告）号：CN117210593B
主分类号：C12Q1/689
分类号：C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/01
优先权：
专利状态码：有效-授权
法律状态：2024.06.14#授权;2023.12.29#实质审查的生效;2023.12.12#公开
摘要：本发明公开了特异性检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的引物组以及检测方法，属于生物技术领域。本发明建立的多重RPA‑CRISPRCas12aCas13a针对Kmt1基因最低检出限为3.4拷贝的质粒，针对LKT基因最低检出限为11拷贝的质粒，在多重RPA结合多重CRISPR‑Cas12aCas13a同时检测Kmt1和Lkt基因时，也具有接近单拷贝检测灵敏性。因此本发明建立了高灵敏性多重RPA‑CRISPRCas12aCas13a同时检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的方法具有高效准确性和灵敏性。
主权项：1.一种非疾病检测或治疗目的地多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的检测方法，其特征在于，以待测样本DNA为模板，利用多重RPA扩增引物组进行扩增反应，再对扩增产物进行Cas12aCas13a一管酶切反应，根据反应完成后的荧光颜色判断待测样本中是否含有多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌；所述多重RPA扩增引物组包括特异性识别多杀性巴氏杆菌的引物和特异性识别溶血性曼氏杆菌的引物；所述特异性识别多杀性巴氏杆菌的引物包括如SEQIDNO.3所示的上游引物和如SEQIDNO.7所示的下游引物；所述特异性识别溶血性曼氏杆菌的引物包括如SEQIDNO.11所示的上游引物和如SEQIDNO.14所示的下游引物；所述对扩增产物进行Cas12aCas13a一管酶切反应为利用CRISPR-Cas12aCas13a系统对扩增产物进行一管酶切反应；所述CRISPR-Cas12aCas13a系统包括：Cas12a蛋白、Cas13a蛋白和crRNA；所述Cas12a蛋白为Cas12a蛋白或具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；所述Cas13a蛋白为Cas13a蛋白或具有与Cas13a的旁路单链RNA切割活性类似的Cas蛋白；所述针对Kmt1的Kmt1-crRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述针对LKT的LKT-crRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 四川省畜牧科学研究院 特异性检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的引物组以及检测方法
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