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申请/专利权人：安徽瑞邦生物科技有限公司
申请日：2024-01-26
公开（公告）日：2024-06-25
公开（公告）号：CN118240854A
主分类号：C12N15/70
分类号：C12N15/70;C12N15/54;C12N1/21;C12P19/32;C12R1/19
优先权：
专利状态码：在审-公开
法律状态：2024.06.25#公开
摘要：本发明公开了全酶法合成NMN四基因共表达载体及工程菌的方法，具体步骤如下：构建双基因表达载体，构建四基因共表达载体pRSFT7，构建四基因共表达突变载体，诱导表达四基因共表达工程菌的构建和酶。本发明实现单载体四基因共表达，只需一个工程菌发酵表达所需酶，简化全酶法合成NMN生产工艺，降低酶生产成本，避免使用昂贵的原料PRPP，并在反应过程循环再生ATP，使得原材料成本大大降低。
主权项：1.一种全酶法合成NMN四基因共表达载体及工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：构建双基因表达载体合成优化密码子的rbk、ppk、nampt三个基因序列，连入表达载体中，分别为pET42a-rbk、pET28a-ppk、pET42a-nampt，另合成引物扩增大肠杆菌基因组的prs基因，通过酶切连入pET42a载体得到pET42a-prs，合成自主设计的pRSFT7Tac共表达载体，设计引物分别扩增prs、nampt基因，分别双酶切回收连入pET42a载体，得到共表达模块A：pET42a-prs-nampt，prs基因与nampt基因之间有核糖体结合位点调节，构建共表达模块B：pET28a-ppk-rbk，ppk基因与rbk基因之间有核糖体结合位点调节；S2：构建四基因共表达载体pRSFT7prs-namptTacppk-rbk通过双酶切将共表达模块A切下，连入pRSFT7Tac载体T7启动子的多克隆位点，得到pRSFT7prs-namptTac，将共表达模块B连入pRSFT7prs-namptTac的Tac启动子多克隆位点，得到pRSFT7prs-namptTacppk-rbk；S3：构建四基因共表达突变载体设计引物改变Tac启动子下游的核糖体结合位点，对表达模块B的表达量进行调整；S4：诱导表达四基因共表达工程菌的构建和酶通过CRISPR-Cas9技术设计引物，构建pEcgRNA-N20载体，扩增同源臂，敲除BL21DE3基因组中的ushA基因，改造表达宿主，避免NMN降解。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 安徽瑞邦生物科技有限公司 一种全酶法合成NMN四基因共表达载体及工程菌的方法
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