申请/专利权人：中国水产科学研究院南海水产研究所;三亚热带水产研究院

申请日：2020-09-07

公开（公告）日：2024-06-25

公开（公告）号：CN112175981B

主分类号：C12N15/74

分类号：C12N15/74;C12N15/03;C12N1/38;C12R1/63

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.25#授权;2021.01.22#实质审查的生效;2021.01.05#公开

摘要：本发明公开了一种基于无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激的哈维弧菌定点基因敲除的方法。它是将哈维弧菌作为受体菌，与供体菌进行接合转移，经同源重组实行哈维弧菌的基因敲除，所述的哈维弧菌是经过无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激处理的哈维弧菌。本发明基于有机物无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激的哈维弧菌定点基因敲除的方法，该方法在传统的接合转移法的技术基础上，通过对接合受体菌哈维弧菌进行有机物无水乙醇或者十二烷基磺酸钠的刺激处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，成功对哈维弧菌进行基因敲除。

主权项：1.一种基于无水乙醇刺激的哈维弧菌定点基因敲除的方法，其特征在于，其包括以下步骤：将培养至对数早期的哈维弧菌受体菌经无水乙醇刺激处理后，用新鲜培养基洗涤后与培养至对数生长期早期的供体菌进行混匀，离心去上清，菌沉淀后重悬，点种至固体平板上，接合过夜，对哈维弧菌进行基因敲除；所述的接合过夜是在28℃接合过夜，所述的供体菌为携带有待缺失片段上下游同源臂的重组自杀质粒的供体菌；所述的无水乙醇，其在含有哈维弧菌的培养液中的终浓度为体积分数12%，刺激时间为10min；所述的供体菌的制备方法是：（1）确定待突变基因hsdM的上下游序列以及自杀质粒pSW7848的插入位点，利用NEB在线软件http:ebuilder.neb.com设计无缝克隆法重组子载体构建引物，得到上游同源臂扩增引物对hsdM-UP-F1R1、下游同源臂扩增引物对hsdM-DOWN-F1R1，自杀质粒线性化引物对pSW7848-FR，重组子质粒检测引物对pSW7848-check-FR及待突变基因缺失检测引物对hsdM-Del-check-F1R1；所述引物序列如下： hsdM-UP-F1：aagcttgatatcgaattcgcagattgaaacttcctatatg hsdM-UP-R1：ccaaggatgagatctatgacatctatcagaag hsdM-DOWN-F1：atagatctcatccttggtttctgcaaac hsdM-DOWN-R1：ttggtaacgaatcagaccagaagctttaaacgctcpSW7848-F：gtctgattcgttaccaattatgacaacpSW7848-R：gaattcgatatcaagcttatcgatacpSW7848-check-F：tcactgtcccttattcgcaccpSW7848-check-R：ctgcttttgagcactacccg hsdM-Del-check-F1：catgttctgcttgctcaagtg hsdM-Del-check-R1：cacgggtcctattgatgctt（2）以序列如SEQIDNO.1所示的hsdM为模板，基于引物对hsdM-UP-F1R1和hsdM-DOWN-F1R1，利用PCR技术获取1003bp的上游同源臂片段UP及1008bp下游同源臂片段DOWN，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；所述的PCR扩增体系如下：2×PrimeSTARMaxPremix25.0μL，上游引物F10μM2.0μL，下游引物R10μM2.0μL，基因组模板20ngμL2.0μL，用ddH2O补足50μL；所述的PCR扩增程序如下：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，50℃5sec，72℃5sec，35个循环；72℃延伸7min；（3）以自杀质粒pSW7848为模板，基于引物对pSW7848-FR，利用PCR技术获取长度为3309bp的质粒线性化片段，琼脂糖电泳检测后切胶回收，回收产物-20℃保存，备用；PCR扩增体系如下：2×PrimeSTARMaxPremix25.0μL，上游引物F10μM2.0μL，下游引物R10μM2.0μL，质粒模板1ngμL2.0μL，用ddH2O补足50μL；PCR扩增程序如下：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，53℃15sec，72℃17sec，35个循环；72℃延伸7min；（4）利用商品化多片段无缝克隆试剂盒ClonExpressMultiSOneStepCloningKit将步骤（2）获得的上下游同源臂与步骤（3）获得的质粒片段进行等温组装；（5）将等温组装液转化入大肠杆菌EscherichiacoliΠ3813感受态细胞，基于引物对pSW7848-check-FR，利用PCR检测后获得阳性重组子pSW7848-△hsdM，其序列如SEQIDNO.2所示，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，长度为2295bp；PCR扩增体系如下：2×PremixTaq™25.0μL，上游引物F10μM2.0μL，下游引物R10μM2.0μL，菌液模板2.0μL，用ddH2O补足50μL；PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃30sec，72℃2.5min，35个循环；72℃延伸10min；（6）提取阳性重组质粒pSW7848-△hsdM转化入大肠杆菌E.coliGEB883感受态细胞，得到携带了重组子的pSW7848-△hsdM-E.coliGEB883，并以其作为接合供体菌。

全文数据：

权利要求：

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