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申请/专利权人：华南师范大学

摘要：本发明公开了一种基于光控的CRISPR‑Cas核酸检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括沉默引导RNA和Cas蛋白；沉默引导RNA是由沉默核苷酸和引导RNA通过退火杂交形成；引导RNA是根据靶标核酸序列设计的，包含重复区和间隔区两个区域；沉默核苷酸与引导RNA的间隔区序列完全互补配对，或者与引导RNA的重复区序列完全配对；沉默核苷酸的碱基之间采用PClinker连接；Cas蛋白为Cas12蛋白或Cas13蛋白。本申请将核酸扩增和CRISPR‑Cas检测在时间上分开，但是可以实现在一个试管里面封闭完成，避免了开盖试剂转移过程，在确保高的检测灵敏度的同时，又保证了检测不受气溶胶污染影响。

主权项：1.一种基于光控的CRISPR-Cas和RPA等温扩增的检测方法，其特征在于：所述的检测方法为非疾病诊断的检测方法，包括以下步骤：（1）将沉默引导RNA、Cas蛋白、荧光报告探针、扩增引物、酶与缓冲液混合配制成预混反应液，加入包含靶标核酸的待测物形成单管内的混合体系；（2）将上述混合体系进行等温扩增，待等温扩增完成，启动UV光照，连接子断裂，沉默核苷酸从引导RNA上脱离，CRISPR-Cas核酸切割反应启动，最后检测所述混合体系中的荧光信号；其中，所述的沉默引导RNA，是由沉默核苷酸和引导RNA通过退火杂交形成；所述引导RNA是根据靶标核酸序列设计的，包含重复区和间隔区两个区域；所述沉默核苷酸与引导RNA的间隔区序列完全互补配对，或者与引导RNA的重复区序列完全配对；所述沉默引导RNA的碱基之间采用可被光激活降解的PClinker连接；所述沉默核苷酸与引导RNA的摩尔浓度比为2:1；所述荧光报告探针为FQC6，序列为FAM-CCCCCC-BHQ1；其中，所述的Cas蛋白为Cas12蛋白，所述的引导RNA如SEQIDNO.1所示，所述的沉默RNA的序列为：uguaau-PClinker-ggaccu-PClinker-caaacc-PClinker-ccaucua，所述的扩增引物为SEQIDNO.36和SEQIDNO.37；或，所述的Cas蛋白为Cas12蛋白，所述的引导RNA如SEQIDNO.38所示，所述的沉默RNA序列为：gugguu-PClinker-uguaug-PClinker-aaauca-PClinker-ccaucua，所述的扩增引物为SEQIDNO.39和SEQIDNO.40；或，所述的Cas蛋白为Cas12蛋白，所述的引导RNA如SEQIDNO.41所示，所述的沉默RNA序列为：gaacgc-PClinker-ugaagc-PClinker-gcuggg-PClinker-ggaucua，所述的扩增引物为SEQIDNO.42和SEQIDNO.43。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 华南师范大学 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法