买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：天津师范大学

摘要：本发明公开了一种水生昆虫肠道菌株降解毒死蜱系统的构建方法及应用。包括幼虫肠道微生物中具有毒死蜱降解潜力菌株的筛选；筛选所得菌株的体外培养和分离纯化；筛选所得菌株的鉴定；菌株降解毒死蜱系统的构建等步骤。本发明公开的菌株降解有机磷农药体系可以避免有机磷农药液体在培养基中溶解度低的影响，从而进行较高浓度有机磷农药的菌株降解实验，因此可以筛选出具有较强有机磷农药降解能力的菌株。

主权项：1.一种从水生昆虫肠道微生物中筛选可降解毒死蜱菌株的方法，包括如下的步骤：一、幼虫肠道微生物中具有毒死蜱降解潜力菌株的筛选；二、筛选所得菌株的体外培养和分离纯化；三、筛选所得菌株的鉴定；四、菌株降解毒死蜱系统的构建，其中：其特征在于：一、水生昆虫幼虫肠道微生物中具有毒死蜱降解潜力菌株的筛选指的是通过亚致死浓度有机磷类农药胁迫培养昆虫幼虫，从而筛选出水生昆虫幼虫肠道中可耐受亚致死浓度有机磷类农药的菌株，步骤如下：（1）以头壳宽度鉴定龄期，选取25只活性较高、体长一致、同龄期的幼虫加入烧杯，设置三组重复；（2）烧杯中各加入150mL亚致死浓度的有机磷类农药溶液，并用气泵持续向烧杯中通入空气；（3）烧杯口用保鲜膜密封防止水分或者助溶剂挥发，胁迫培养24h；四、菌株降解毒死蜱系统的构建，主要包括：构建菌株降解毒死蜱系统和各菌株毒死蜱降解能力，步骤如下：Ⅰ.配制毒死蜱溶液及培养种子液（1）用有机系微孔滤膜抽滤石油醚两次，去除石油醚中的杂质；（2）将有机磷类农药溶于石油醚中，得到60mgL有机磷类农药的石油醚溶液；（3）配制普通肉汤液体培养基LB400mL并121℃高压蒸汽灭菌20min，各菌株纯化培养后挑起单菌落接种至普通肉汤液体培养基中，最后放入摇床中，37℃、160rpm培养12h；所述的LB培养基成分如下：胰蛋白胨10.0gL酵母提取物5.0gL氯化钠10.0gL；（4）培养12h后将菌液浓度调制OD600时，吸光度为1.00，获得种子液；Ⅱ.构建菌株降解有机磷类农药系统（1）配制M9低盐培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min；所述的M9低盐培养基成分如下：磷酸氢二钠七水合物25.6gL，磷酸二氢钾6gL，氯化钠1gL，氯化铵2gL；（2）将种子液8000rpm离心10min，倒去上清保留菌体；（3）倒入50mLM9低盐培养基混匀8000rpm离心10min，倒去上清保留菌体以洗去浊液；（4）重复步骤（3）一次；（5）倒入50mLM9低盐培养基混匀，之后倒入灭菌后的锥形瓶中，再倒入60mgL有机磷农药石油醚溶液50mL，用耐高温组胚封口膜封口；（6）将菌株降解毒死蜱系统放入摇床中37℃、160rpm培养；Ⅲ探究各菌株毒死蜱降解能力（1）将农药溶于抽滤后石油醚中，配制浓度为250μgL、200μgL、150μgL、100μgL、50μgL的农药石油醚溶液，备用；（2）每个浓度各取200μL加至96孔板中，每组三个重复；（3）将96孔板置于酶标仪中，以抽滤后的石油醚为空白，特定波长下测定吸光值，每孔三个机械重复；（4）以有机磷农药浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，使用Excel绘制标准曲线；（5）将锥形瓶从摇床中取出，常温静置20min；（6）每瓶中各取上清液1mL，8000rpm离心15min；（7）取离心后的上清200μL加至96孔板中，每组三个重复；（8）将96孔板放置酶标仪中，以抽滤后的石油醚为空白，测定吸收值，每孔三个机械重复；（9）重复上述实验测定24h、48h、72h、96h的吸光值；（10）根据标准曲线与吸光值计算相应的有机磷农药浓度；（11） 。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 天津师范大学 一种水生昆虫肠道菌株降解毒死蜱系统的构建方法及应用