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申请/专利权人：陕西佰美基因股份有限公司

摘要：本发明涉及一种检测CYP2D6基因拷贝数的方法，尤其涉及一种基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法、引物对与非标记探针组合及试剂盒。克服传统检测基因拷贝数方法存在的成本高、周期长及普适性低等缺陷。方法包括以下步骤：1非标记探针、生物素标记下游引物和上游引物的设计及合成；2获取待测样本的基因组DNA；3配制PCR反应体系；4进行PCR反应；5利用链霉亲和素标记的磁珠获取单链PCR产物；6熔解曲线分析及CYP2D6基因拷贝数判定。本发明在不需要荧光探针的前提下，即可完成CYP2D6基因拷贝数分析。

主权项：1.一种基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、设计非标记探针、上游引物和生物素标记下游引物；根据人CYP2D6基因以及CYP2D8P基因的序列特点，设计非标记探针、上游引物和生物素标记下游引物；生物素标记下游引物、上游引物及非标记探针如下：5’-生物素标记下游引物18nt：5’-生物素-CCTGTACCCTTCCTCCCT-3’上游引物18nt：5’-TGGTGGCTGACCTGTTCT-3’非标记探针20nt：5’-TGATCCTACATCCGGATGTG-spacer-3’；步骤2、获取待测样本的基因组DNA；步骤3、配制反应体系；在同一反应体系中加入待测样本的基因组DNA、上游引物、生物素标记下游引物、DNA聚合酶，dNTPs脱氧核糖核苷三磷酸以及PCRBuffer；步骤4、进行PCR反应；将配制好的反应体系置于PCR仪进行PCR反应，实现基因扩增；步骤5、获取单链PCR产物；吸附带有生物素标记的双链PCR产物，并通过诱导DNA变性，分离得到带有生物素标记的单链PCR产物；步骤6、分析熔解曲线并判定CYP2D6基因的拷贝数；将单链PCR产物、非标记探针和双链荧光染料混合孵育，进行熔解反应，绘制熔解曲线，进行熔解曲线分析；根据熔解曲线中CYP2D6基因和CYP2D8P基因产物熔解峰的荧光强度比值，判定待测样本CYP2D6基因的拷贝数，具体为：CYP2D8P熔解峰荧光值CYP2D6熔解峰荧光值＝K·CYP2D8P拷贝数CYP2D6拷贝数，其中K是一个常数；若待测样本的CYP2D8P熔解峰荧光值CYP2D6熔解峰荧光值在1.31～1.51之间，则该待测样本的CYP2D6基因拷贝数为1；若待测样本的CYP2D8P熔解峰荧光值CYP2D6熔解峰荧光值在0.91～1.20之间，则该待测样本的CYP2D6基因拷贝数为2；若待测样本CYP2D6熔解峰缺失，仅存在CYP2D8P熔解峰，则该待测样本的CYP2D6基因拷贝数为0；所述方法不涉及疾病的诊断和治疗。

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