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申请/专利权人：安徽农业大学

摘要：本发明涉及一种重叠PCR酶切联用的鉴定方法及试剂盒，所述方法包括以N4N5X或N4N5Y作为引入的酶切位点的后三碱基，选择对应的限制性内切酶，若无对应的限制性内切酶可选时，再以N5X或N5Y作为引入的酶切位点的后二碱基，选择对应的限制性内切酶；XY为SNP位点碱基或InDel差异的第一个碱基，N4N5为XY位的前两个碱基，对应酶切位点的第45位碱基；扩增获得通用片段初次PCR产物；根据限制内切酶和通用引物设计PCR扩增引物并获得待测模板初次PCR产物；对两者重叠PCR扩增的终产物进行酶切基因分型。本发明利用DOPCR法鉴定SNPInDel，与现有创造酶切位点方法相比，增加了重叠PCR的步骤，酶切片段差异显著，无需PAGE电泳，普通电泳便可完成检测，成本低且快速。

主权项：1.一种重叠PCR酶切联用的鉴定方法，用于检测SNPInDel分子标记，其特征在于，具体步骤如下：步骤一：根据SNPInDel分子标记的存在位置及突变形式，以N4N5X或N4N5Y作为引入的酶切位点的后三碱基，选择对应的限制性内切酶，若无对应的限制性内切酶可选时，再以N5X或N5Y作为引入的酶切位点的后二碱基，选择对应的限制性内切酶；其中，XY为SNP位点碱基或InDel差异的第一个碱基，N4N5为XY位的前两个碱基，对应酶切位点的第45位碱基；步骤二：利用通用片段设计通用引物UF、UR，并用通用引物UF、UR对通用片段进行扩增，获得通用片段初次PCR产物，所述通用片段初次PCR产物不含酶切位点；所述通用引物UF、UR的结构为：通用引物UF：5’-固定序列1+通用片段上游扩增序列-3’，通用引物UR：5’-固定序列2+通用片段下游扩增序列-3’；步骤三：根据步骤一选出的限制内切酶和步骤二设计的通用引物设计MP引物、AP引物，并利用MP引物和AP引物对SNPInDel分子标记所在的待测模板进行扩增，获得待测模板初次PCR产物；所述MP引物、AP引物的结构为：按后三碱基选择限制性内切酶时，MP引物为：5’-固定序列2的反向互补序列+待测模板上游扩增序列+酶切位点E1E2E3E4E5-3’；按后二碱基选择限制性内切酶时，MP引物为：5’-固定序列2的反向互补序列+待测模板上游扩增序列+酶切位点E1E2E3E4E5E6-3’；其中，E1、E2、E3、E4、E5、E6分别为酶切位点的第1-6位碱基，待测模板上游扩增序列为N1位碱基前的部分待测模板序列，N1为XY位前的第5个碱基。AP引物为：5'-固定序列1+待测模板下游扩增序列-3'；步骤四：利用通用引物UF设计OP引物，并通过OP引物将步骤二所获得的通用片段初次PCR产物和步骤三所获得的待测模板初次PCR产物进行重叠PCR，扩增出终产物，所述OP引物为：5’-固定序列1-3’；步骤五：利用步骤一选出的限制内切酶对步骤五所获得的终产物进行酶切获得酶切产物，根据酶切结果进行判断待测样品的SNPInDel类型。

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