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申请/专利权人：云南省烟草农业科学研究院

摘要：本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种鉴定生物体中外源导入片段是否缩短的方法及其应用。提供一种鉴定生物体中外源导入片段是否缩短的方法，其包括：a基于外源导入片段两端的核苷酸序列设计并合成两个引物对，第一引物对能够特异性扩增外源导入片段左端的特征序列；第二引物对能够特异性扩增外源导入片段右端的特征序列；b以含有外源导入片段的待测生物体的基因组DNA为模板，使用第一引物对、第二引物对和KASP预混液进行PCR；cPCR结束后，根据扩增产物的荧光信号判断待测生物体中外源导入片段是否缩短。该方法具有准确性高、成本低廉、检测效率高等优点，适用于大规模育种筛查。

主权项：1.鉴定生物体中外源导入片段是否缩短的方法，其包括：a基于外源导入片段两端的核苷酸序列设计并合成两个引物对，其中第一引物对能够特异性扩增外源导入片段左端的特征序列，其上游引物的5’端含有第一接头序列；第二引物对能够特异性扩增外源导入片段右端的特征序列，其上游引物的5’端含有第二接头序列；并且两个引物对均不会扩增待测生物体的原基因组序列；b以含有外源导入片段的待测生物体的基因组DNA为模板，使用第一引物对、第二引物对和KASP预混液进行PCR；所述KASP预混液中包含第一荧光探针、第一淬灭探针、第二荧光探针、第二淬灭探针；第一荧光探针的核苷酸序列与第一接头序列一致，并且与第一淬灭探针的核苷酸序列反向互补；第二荧光探针的核苷酸序列与第二接头序列一致，并且与第二淬灭探针的核苷酸序列反向互补；第一荧光探针的5’端标记有第一荧光基团，并且第一淬灭探针的3’端标记有相应的淬灭基团；第二荧光探针的5’端标记有第二荧光基团，并且第二淬灭探针的3’端标记有相应的淬灭基团；第一荧光基团发出的第一荧光信号不同于第二荧光基团发出的第二荧光信号；cPCR结束后，检测扩增产物的荧光信号；若同时检测到第一荧光信号和第二荧光信号，则待测生物体中的外源导入片段没有缩短；若只检测到第一荧光信号，则待测生物体中的外源导入片段的右端缩短；若只检测到第二荧光信号，则待测生物体中的外源导入片段的左端缩短；若没有检测到荧光信号，则待测生物体中的外源导入片段两端均缩短。

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