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申请/专利权人：杭州孚斯泰生物技术有限公司

摘要：本发明提供了一种基于距离信号输出的靶核酸即时检测方法，具体包含一种CRISPRCas12响应的DNA智能水凝胶和基于距离信号输出的纸基微流控芯片。反应流程包括：1对待测样品中的总核酸进行提取；2借助等温扩增技术对核酸检测片段进行扩增；3通过CRISPRCas12a体系对扩增片段进行识别，利用其核酸酶活性对DNA智能水凝胶进行切割，并释放其中包埋的信号分子；4借助纸基微流控芯片上的级联酶反应对信号进行转导，最终借助芯片上色柱的距离信号进行检测结果的读取。该方法操作便携，无需大型仪器辅助，成本低廉，且保持了传统CRISPRCas12体系选择性好、灵敏度高的优点，具有应用前景。

主权项：1.一种非诊断目的的基于距离信号输出的靶核酸即时检测方法，其特征在于，包括如下检测步骤：步骤一：对待测样品中的总核酸进行提取；步骤二：借助核酸扩增技术对待测样品中的靶核酸片段进行扩增；步骤三：在crRNA的介导下，Cas12a核酸酶特异性识别扩增产物中的靶核酸片段，利用其核酸酶活性对预先制备的DNA智能水凝胶进行切割，释放其中包埋的信号分子，并与其相应的底物进行反应；步骤四：借助纸基微流控芯片上的级联酶反应对信号进行转导，借助芯片上色柱的距离信号进行检测结果的读取；所述的DNA智能水凝胶由具备相同黏性末端的分支型骨架DNA和分支型交联剂DNA经自组装形成；分支型骨架DNA和分支型交联剂DNA由单链DNA部件经分子内间杂交而形成；所述分支型骨架DNA为Y型骨架DNA，所述分支型交联剂DNA为L型交联剂DNA，二者自组装形成水凝胶，Y型骨架所使用的单链DNA部件为Y1、Y2、Y3，L型交联剂所使用的单链DNA部件为L1、L2；Y1、Y2、Y3单链DNA部件浓度为400μM-800μM，L1、L2单链DNA部件浓度为250μM-550μM，具体序列为：Y1，即SEQIDNo.1序列：5’-CGATTGACCACGCTGTCCTAACCATGACCGTCGAAG-3’Y2，即SEQIDNo.2序列：5’-CGATTGACCTTCGACGGTCATGTACTAGATCAGAGG-3’Y3，即SEQIDNo.3序列：5’-CGATTGACCCTCTGATCTAGTAGTTAGGACAGCGTG-3’L1，即SEQIDNo.4序列：5’-GTCAATCGTTATTATTATTTCTATTCGCATGAGGATCCCAT-3’L2，即SEQIDNo.5序列：5’-GTCAATCGTTATTATTATTATGGGATCCTCATGCGAATAGA-3’；水凝胶所包埋的信号分子为：具有催化水解产生葡萄糖功能的产糖酶，借助其催化活性将相应的反应底物水解产生葡萄糖；所述的信号分子包括：淀粉酶，转化酶，半乳糖苷酶，葡聚糖酶，其相应的反应底物包括：淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖；所使用的纸基微流控芯片至少存在一个上样区与一个矩形通道；上样区吸附有葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶，矩形通道吸附有二氨基联苯胺；步骤四中，葡萄糖氧化酶用量为0.5-5U，辣根过氧化物酶用量为0.5-5U，二氨基联苯胺浓度为5-20mgmL。

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