买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：石家庄圣博生物科技有限公司;河北科技师范学院

摘要：本发明公开了一种肠炎沙门菌eutR基因缺失株的构建方法，涉及基因缺失株研究技术领域。本发明包括以下步骤：1提取pKD3质粒，以P1、P2为引物，质粒pKD3为模板扩增；2挑取C50336‑pKD46菌株单克隆摇菌制备种子液，次日转接至LBA液体培养基；3离心弃上清；用预冷的10％甘油重悬；4电转；5离心弃去部分上清，将剩余菌液均匀涂布在LBC固体培养基上，用引物P3、P4进行PCR鉴定；6电转，引物P3、P4进行PCR鉴定，阳性菌株命名为C50336ΔeutR。本发明利用小鼠进行了体内毒力评价，证明eutR基因缺失株显著下降，结果进一步表明eutR基因影响肠炎沙门菌毒力。

主权项：1.肠炎沙门菌eutR基因缺失株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1将pKD3-DH5α复苏，根据质粒提取试剂盒说明书提取pKD3质粒，以P1、P2为引物，质粒pKD3为模板扩增获得含eutR基因同源臂的氯霉素片段，进行胶回收；P1：5’-GACTATCACCGCCTGGCAGCAGATCTACGATCAGTTACACCCGGGTAAATTTCATGGCGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’，如SEQIDNo.1所示；P2：5’-TGATGCTTTCGGCGCTATGAATCGGCTTCGCCTCTTCCAGCATCGTGCCCATCGCCAGCCATATGAATATCCTCCTTAG-3’，如SEQIDNo.2所示；所述打靶片段如SEQIDNo.7所示；2挑取C50336-pKD46菌株单克隆摇菌制备种子液，次日按1：100转接至LBA液体培养基中，37℃180rmin2h后加入阿拉伯糖诱导4h～6h，冰浴30min；34℃6000rmin离心10min，弃上清；使用预冷的蒸馏水洗涤两次，离心后去上清，用预冷的10％甘油重悬，进行分装，每管100μL，此步骤所有过程均在冰上进行；4取出打靶片段置于冰上融化，使用电转仪将2μL打靶片段电转至100μLC50336-pKD46感受态细胞中，迅速向电击杯中加入1mL预冷的LB液体培养基，30℃180rmin复壮2h；5离心弃去部分上清，将剩余菌液均匀涂布在LBC固体培养基上，37℃倒置培养过夜；次日，挑取单克隆摇菌，用引物P3、P4进行PCR鉴定，阳性菌株于42℃水浴4h～6h消除pKD46，命名为C50336ΔeutR::Cat；P3：5’-AAAGACCCGTACAGCGAATT-3’，如SEQIDNo.3所示；P4：5’-GTCAGCGGCTCCGACATA-3’，如SEQIDNo.4所示；6将2μL质粒pCP20电转至100μLC50336ΔeutR::Cat感受态中，迅速向电击杯中加入1mL预冷的LB液体培养基，37℃180rmin复壮1h用引物P3、P4进行PCR鉴定，阳性菌株于42℃水浴4h～6h消除pCP20，阳性菌株命名为C50336ΔeutR。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 石家庄圣博生物科技有限公司 河北科技师范学院 一种肠炎沙门菌eutR基因缺失株的构建方法