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申请/专利权人：山东兴瑞生物科技有限公司

摘要：本发明提供一种偶联CD8抗体的肿瘤mRNA疫苗的制备方法，属于医用配制品技术领域，所述制备方法包括确定突变多肽、突变多肽的初筛、筛选高亲和性肽段、整合得到新生抗原多肽、获得免疫原性强的新生抗原多肽、新生抗原多肽的优化、合成mRNA、制备包载mRNA的LNP、偶联CD8抗体；本发明采用mRNA‑LNP偶合CD8抗体，可以直接靶向CD8+T细胞，被CD8+T细胞吞噬，刺激细胞因子的分泌，提高对肿瘤细胞的体外杀伤效率，提高肝癌模型小鼠的生存率；本发明对mRNA中HLA‑A分型的新生抗原多肽的氨基酸序列的优化，明显提高CD8抗体偶联的mRNA疫苗对于肝癌细胞的体外杀伤效率以及肝癌模型小鼠的生存率。

主权项：1.一种偶联CD8抗体的肿瘤mRNA疫苗的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括确定突变多肽、突变多肽的初筛、筛选高亲和性肽段、整合得到新生抗原多肽、获得免疫原性强的新生抗原多肽、新生抗原多肽的优化、合成mRNA、制备包载mRNA的LNP、偶联CD8抗体；所述确定突变多肽步骤中，对于插入缺失突变产生的移码肽，在整段移码肽的N端添加非突变氨基酸得到突变多肽；所述筛选高亲和性肽段的方法为根据初筛后突变多肽序列和HLA分型结果，筛选出与MHC亲和性高的9-14mer的多肽序列；所述获得免疫原性强的新生抗原多肽的方法为将新生抗原多肽合成后，利用试剂盒测试其免疫原性，选取免疫斑点数比阳性对照多的新生抗原多肽，即为免疫原性强的新生抗原多肽；所述新生抗原多肽的优化的方法为以免疫原性强的新生抗原多肽中HLA-A分型为目标分型，从IEDB公共数据库中收集该分型的抗原表位，分析序列保守性特征，确定第1位和第2位的偏好氨基酸，然后将免疫原性强的新生抗原多肽中与HLA-A分型结合的新生抗原多肽的氨基酸序列的第1位和第2位优化为上述偏好氨基酸，得到优化后的HLA-A分型的新生抗原多肽；所述合成mRNA的方法为将免疫原性强的新生抗原多肽按照免疫斑点数从多到少的顺序连接，N端添加His标签，并采用优化后的HLA-A分型的新生抗原多肽替代原HLA-A分型的新生抗原多肽，合成mRNA；所述CD8抗体的重链氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：32所示，轻链氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：33所示。

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