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申请/专利权人：天津大学
摘要：本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大尺度DNA体内迭代组装的方法。该方法将大尺度DNA的待组装片段分别转入预先进行过着丝粒修饰的交配型不同的两个宿主中，借助CRISPRCas9系统在着丝粒附近产生DSB诱导染色体删除和酵母同源重组，同时实现了待组装DNA片段的组装和被修饰染色体的整套删除，获得了含组装片段的单倍体宿主，之后可以立即与另一种交配型宿主携带另一待组装片段进行交配，开启下一轮组装。经多轮迭代组装，最终在体内实现大尺度DNA的迭代组装。实验表明，经过5轮迭代可实现由32Kb到1024Kb的组装，最重要的是组装过程仅需共培养两种交配型的酵母，无需任何繁琐低效的大尺度DNA提取分离纯化步骤，也无需复杂漫长的生孢与拆孢过程，操作简单、周期短。
主权项：1.一种大尺度DNA体内迭代组装的方法，其特征在于，包括：1构建包含携带有Cas9基因和靶向XT片段的sgRNA-XT的单倍体化质粒以及携带有待组装DNA片段A的受体质粒的宿主，获得第1代组装的受体宿主；向另一宿主中每条染色体着丝粒的一端20～200bp的位置插入XT片段，另一端插入XT片段和筛选标记基因的融合片段XT-lable，同时转入含待组装DNA片段B的供体质粒，获得第1代组装的供体宿主；诱导所述第1代组装的受体宿主和所述供体宿主进行细胞融合；在融合过程中，DNA片段A和B经同源重组完成组装，同时sgRNA-XT引导Cas9在XT修饰的染色体的着丝粒两端切割，引起双链DNA断裂，导致XT修饰的染色体全部缺失，获得含片段A+B的第1代单倍体宿主；其中，所述XT片段由PAM序列和长度为20bp的随机序列K组成；所述随机序列K与宿主基因组序列不同源；所述供体质粒还包括：靶向受体质粒上切割位点S1的sgRNA-S1和Cas9切割位点S2；所述受体质粒还包括：靶向供体质粒上切割位点S2的sgRNA-S2和Cas9切割位点S1；所述待组装的每两个相邻的DNA片段含有100bp～500bp的同源序列；2按照大尺度DNA的序列采用步骤1的过程组装其余的待组装DNA片段，直至完成所有DNA片段的组装，获得大尺度DNA片段全长。
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权利要求：
百度查询： 天津大学 一种大尺度DNA体内迭代组装的方法
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