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申请/专利权人：海南医学院

摘要：本发明公开了一种用于miRNA检测的探针及其检测方法和应用，涉及检测技术领域。所述探针包括挂锁探针、SERS探针和含有DNA的磁球@ZIP链，所述挂锁探针能特异性结合miRNA、SERS探针和磁球@ZIP链，包括：目标识别位点：包括位于挂锁探针长链两端的核苷酸序列D1和核苷酸序列D2，所述D1和D2能与待检测的miRNA完全互补地结合，且在T4DNA连接酶的作用下形成一个圆形结构；SERS探针连接子：为与序列D1和D2相连的P区域，用于SERS探针的识别和富集；磁珠连接子：分别与两端的SERS探针连接子P连接，其核苷酸序列与磁球@ZIP链上的DNA序列互补。本发明结合了等温扩增技术和拉曼散射技术，通过设计特殊探针并实现信号的放大，能够提高miRNA检测的灵敏度，减少对患者的损伤和并发症产生的几率。

主权项：1.一种检测miRNA的方法，其特征在于，所述方法为非诊断目的，包括如下步骤：进行滚环扩增反应，向反应管中加入待检测的miRNA、挂锁探针、DNA连接酶和反应缓冲液，以miRNA作为引物，与挂锁探针相互作用成环，然后将成环产物作为模板，加入含有DNA的磁球@ZIP链作为引物，加入dNTP、Phi29DNA聚合酶、DTT和反应缓冲液，混合均匀，产生含有待检测的miRNA片段的长链产物磁球@RCA；向磁球@RCA中加入DNA-AuNP结合物，混合反应，得到磁球@RCA@AuNP复合物；通过磁球@RCA@AuNP复合物对SERS探针进行识别和富集，检测上清液中SERS的信号强度；所述挂锁探针能特异性结合miRNA、SERS探针和含有DNA的磁球@ZIP链，挂锁探针具有D1-P-zip-P-D2模式结构，且所述挂锁探针序列不形成稳定的二级结构，包括：目标识别位点：所述目标识别位点包括位于挂锁探针两端的核苷酸序列D1和核苷酸序列D2，所述D1和D2能与待检测的miRNA完全互补地结合，且在T4DNA连接酶的作用下形成一个圆形结构；SERS探针连接子：所述SERS探针连接子为与序列D1和D2相连的P区域，所述SERS探针连接子用于SERS探针的识别和富集；磁珠连接子：所述磁珠连接子zip两端分别与两端的SERS探针连接子P连接，所述磁珠连接子zip的核苷酸序列与磁球@ZIP链上的DNA序列互补，使其能够被磁珠识别连接；所述SERS探针的制备方法包括如下步骤：采用“金种子生成法”制备金纳米颗粒AuNPs溶液，用拉曼报告分子孔雀石绿异硫氰酸酯MGITC修饰金纳米颗粒AuNPs，得到SERS探针AuNP@MGITC；所述含有DNA的磁球@ZIP链制备方法包括如下步骤：重悬链霉亲和素磁珠，分离去除上清，洗涤，用BindingWashingBufferI重悬磁珠，加入生物素标记核酸样品，充分振荡混悬，室温孵育，然后分离去除上清，继续用BindingWashingBufferI重悬磁珠，得到含有DNA的磁球@ZIP链；DNA-AuNP结合物采用如下方法制备：将金纳米颗粒AuNPs溶液与巯基修饰的DNA混合，微波加热反应，用PBS磷酸盐重悬缓冲液，然后用磷酸盐缓冲液洗涤颗粒，离心得到沉淀，将所述沉淀重悬于PBS缓冲液中，得到DNA-AuNP结合物，所述巯基修饰的DNA与所述挂锁探针的SERS探针连接子P区域的核苷酸序列相同。

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