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申请/专利权人：贵州茅台酒股份有限公司

摘要：本申请属于生物工程领域，具体涉及一种构建重组质粒对样本中真菌进行绝对定量的方法。方法包括先获得待测样本中真菌的种类，然后以这些真菌的ITS2基因分别构建重组质粒，最后将这些重组质粒进行混合并以混合质粒中各重组质粒的的reads数为依据直接计算得到各真菌在待测样本中的浓度，避免了微生物计数的步骤，操作更为简便，利用本发明的方法对样本中真菌进行绝对定量的目的性较强、准确性较高。

主权项：1.一种对样本中的真菌进行绝对定量的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取待测样本的基因组DNA；S2、对步骤S1提取的基因组DNA进行测序，获得样本中真菌种类；S3、向待测样本中加入内参，所述内参的序列如SEQIDNO.：1所示，加入内参至内参的浓度为1×107copiesmL；S4、将待测样本中在步骤S2测得的各真菌的ITS2分别导入质粒中，构建携带真菌ITS2基因的重组质粒；S5、将步骤S4构建的各重组质粒与步骤S3所述的内参按照数量比等比例混合，得到混合物，混合物中各重组质粒和内参的含量均为1×107copiesg；S6、检测：S6.1、检测S3制备的含有内参的待测样本的以下参数：含有内参的待测样本中此真菌的reads数R1，和含有内参的待测样本中内参的reads数R2；S6.2、检测S5制备的混合物中的以下参数：携带某真菌ITS2基因的重组质粒在混合物中的reads数r1，和内参在混合物中的reads数r2；S7、计算步骤S2测得的各真菌在待测样本中的浓度，计算公式为：样本中某一真菌的浓度=（R1R2）×某一真菌的矫正因子；某一真菌的矫正因子=携带此真菌ITS2基因的重组质粒在混合物中的浓度c×（r1r2）；所述真菌选自库德里阿兹氏毕赤酵母（Pichiakudriavzevii）、胶红酵母（Rhodotorulamucilaginosa）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsisfibuligera）、德尔布有孢圆酵母（Torulasporadelbrueckii）、小孢根霉（Rhizopusmicrosporus）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、宛氏拟青霉（Paecilomycesvariotii）和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）中的至少一种；所述步骤S4中的IT2的序列如SEQIDNO.:4-12中的至少一种所示；所述样本为大曲。

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权利要求：

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