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申请/专利权人：南宁汉和生物科技股份有限公司

摘要：本发明公开了一种表达谷氨酸氧化酶的工程菌及其应用。将谷氨酸氧化酶基因插入pP43NMK质粒中，将质粒中原本的RBS替换为RBS多拷贝串联序列，将构建的重组质粒导入枯草芽孢杆菌宿主中表达。本发明在枯草芽孢杆菌中构建组成型启动子驱动谷氨酸氧化酶基因的转录，通过多拷贝RBS串联的方式提高mRNA的翻译效率，从而提高谷氨酸氧化酶的表达。经试验结果表明，该工程菌经RBS改造后，全细胞转化的α‑酮戊二酸产量大幅提升，提高了40%，此改造策略对食品安全级菌株枯草芽孢杆菌生产α‑酮戊二酸的工业化奠定了理论基础。

主权项：1.一种表达谷氨酸氧化酶的工程菌及其应用，其特征在于，将谷氨酸氧化酶基因插入pP43NMK质粒中，将质粒中原本的RBS替换为RBS多拷贝串联序列，将构建的重组质粒导入枯草芽孢杆菌宿主中表达，生产α-酮戊二酸。包括以下步骤：步骤1、谷氨酸氧化酶基因序列的扩增：人工合成谷氨酸氧化酶的编码基因的核苷酸序列SEQIDNo.1，设计PCR引物SEQIDNo.2和SEQIDNo.3，通过PCR反应扩增得到谷氨酸氧化酶基因序列；步骤2、线性化载体片段的扩增：以SEQIDNo.4和SEQIDNo.5为引物，以pP43NMK质粒为模板通过PCR扩增得到线性化载体片段；步骤3、重组质粒的构建：将步骤1所述的谷氨酸氧化酶基因序列和步骤2所述的线性载体片段通过无缝克隆试剂盒构建重组质粒pP43NMK-Lgox；步骤4、RBS改造：将重组质粒pP43NMK-Lgox上RBS进行改造，以SEQIDNo.6和SEQIDNo.7为引物，以重组质粒pP43NMK-Lgox为模板，反向PCR扩增重组质粒pP43NMK-Lgox得到pP43NMK-Lgox-RBS质粒；步骤5、多拷贝RBS串联：在重组质粒pP43NMK-Lgox-RBS上的RBS前增加一拷贝的SEQIDNo.8和SEQIDNo.9。以SEQIDNo.10和SEQIDNo.11为引物，以pP43NMK-Lgox-RBS质粒为模板，反向PCR扩增质粒，得到pP43NMK-Lgox-2RBS质粒，以上操作为一个实验循环，重复3次，得到重组质粒pP43NMK-Lgox-4RBS；步骤6、枯草芽孢杆菌的构建：将pP43NMK-Lgox-4RBS电转化至B.subtilisWB600枯草芽孢杆菌感受态细胞，即得到B.subtilisWB600pP43NMK-Lgox-4RBS重组工程菌。

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