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申请/专利权人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

摘要：本发明属植物种质资源保存领域，涉及一种巴戟天试管苗茎尖超低温保存的方法，以经过预处理的巴戟天试管苗为材料，诱导腋芽萌发伸长，1个月后取顶端茎尖经高浓度蔗糖预配养、甘油加载和PVS3冷冻保护等处理后于液氮生物保存罐中进行超低温保存的方法。本发明以巴戟天试管苗茎段诱导腋芽萌发伸长所获得的茎尖为外植体，经过高浓度蔗糖预配养、甘油加载和PVS3冷冻保护后于液氮生物保存罐中进行超低温保存，具有再生率高、节约空间等特点，能够满足巴戟天珍惜濒危资源长期安全保存的需要，为巴戟天资源保护、超低温疗法病毒脱除和抗逆评价奠定基础。

主权项：1.一种巴戟天试管苗茎尖超低温保存的方法，其特征在于，具体步骤如下：1巴戟天试管苗预处理将巴戟天试管苗于继代培养基上进行继代培养3～5个月，环境温度为22～26℃，光照强度为1000～1500lx，光周期为12h；所述继代培养基为MS+蔗糖30gL+6-BA0.5mgL+NAA0.1mgL+琼脂8gL，pH为5.8；2保存材料获取取经过继代培养的巴戟天试管苗，切取带有腋芽的茎段于诱导培养基上进行培养，诱导腋芽萌发伸长，诱导环境温度为22～26℃，光照强度为1000～1500lx，光周期为12h；诱导腋芽萌发伸长4～5周后，切取顶端2～3mm大小的茎尖得到超低温保存材料；所述诱导培养基为MS+蔗糖30gL+6-BA0.5～1.0mgL+NAA0.1～0.2mgL+琼脂8gL，pH为5.8；3茎尖预培养将茎尖于含有0.3M蔗糖的MS液体培养基中黑暗下预培养16～24h，随后将茎尖移至含有0.6M蔗糖的MS液体培养基中进一步培养3～4天，培养基pH为5.8；4茎尖冷冻保护将经过高浓度蔗糖预培养后的茎尖转入甘油加载液中浸泡处理0.5～1.0h，然后转入PVS3冷冻保护液中于24～26℃浸泡处理50～60min；所述甘油加载液是指含有2.0M甘油和0.6M蔗糖的MS液体培养基，pH为5.8；PVS3冷冻保护液为添加有1.46M蔗糖和5.43M甘油的MS液体培养基，pH值为5.8；5茎尖超低温保存茎尖完成冷冻保护后转至铝箔条上，并随铝箔条迅速投入液氮中；将冷冻管充分预冷后将铝箔条转入冷冻管，接着将冷冻管装入充分预冷的冷冻盒中并于液氮生物保存罐中进行超低温保存。

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