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申请/专利权人：江苏大学

摘要：本发明属于生物技术和基因工程领域，涉及一种底物广谱性葡萄糖氧化酶的制作方法及在秸秆降解转化中的应用。本发明利用枯草芽孢表面展示系统，选择CotG作为表面展示的锚定蛋白，优化设计不同类型连接肽，将来源于出芽短梗霉的葡萄糖氧化酶基因与枯草芽孢杆菌的衣壳蛋白基因融合，并在枯草芽孢杆菌表面成功展示该融合蛋白。这种表面展示的葡萄糖氧化酶具有广泛的底物适应性，可与多种酶混合，显著提高秸秆的降解转化效率。本发明不仅简化了酶的生产过程，还提高了酶的稳定性和活性，使得葡萄糖氧化酶的两个亚基能够相对自由地调整位置和构象，以适应不同底物的结合需求，为生物质资源的开发利用提供了新的思路和技术手段，市场应用前景广阔。

主权项：1.一种底物广谱性葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1将来源于出芽短梗霉Aureobasidiumsp.的葡萄糖氧化酶基因序列根据枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis密码子偏好性进行优化，获得编码AreGOD的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；2以步骤1中所述的AreGOD核苷酸序列为模板，进行PCR扩增，得到扩增的目的基因；并将扩增的目的基因整合至枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pHS-cotG上；然后在扩增的目的基因与衣壳蛋白之间插入连接肽LK形成枯草芽孢杆菌表面展示质粒，转入大肠杆菌中，经过抽提质粒，获得重组芽孢展示质粒命名为pHS-cotG-LK-AreGOD；并将pHS-cotG-LK-AreGOD导入枯草芽孢杆菌WB800N中，获得可用于芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的工程菌，命名为B.subtilispHS-cotG-LK-AreGOD；3将步骤2中获取的工程菌B.subtilispHS-cotG-LK-AreGOD接种到含有氯霉素的LB培养基中，经第一次培养后得到培养液；再将培养液接种到含有氯霉素的DSM液体培养基中，经第二次培养后离心收集菌体沉淀，使用含有溶菌酶的GTEBuffe将沉淀重悬，得到重悬液经孵育后离心收集沉淀并使用PBSBuffer清洗，清洗后收集沉淀再次重悬于PBSBuffer中，得到表面展示有葡萄糖氧化酶的重组孢子蛋白悬液；或将清洗后收集沉的淀经低温干燥处理，得到固体粉剂；所述重组孢子蛋白悬液或固体粉剂均为底物广谱性的葡萄糖氧化酶，命名为B.subtilisCotG-LK-AreGOD。

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百度查询： 江苏大学 一种底物广谱性葡萄糖氧化酶的制备方法及在秸秆降解转化中的应用