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申请/专利权人：东南大学

摘要：本发明公开了一种基于瞬态编码的空间转录组测序解码方法，包括如下步骤：基于寡核苷酸链编码的空间信息编码微球的设计；瞬态编码引物的设计与使用；组织切片处理及信使RNA的捕获；建库测序及分析定位。本方法可以获得高分辨的空间转录组测序，极限情况下可以达到亚细胞分辨率5μm，从而可以准确获取组织切片中特定位点上的基因表达情况；本方法成本低廉，规避了成本高昂的光学空间位置信息解码，使得本方法可以以近乎单细胞转录组测序的成本进行空间转录组测序。

主权项：1.一种基于瞬态编码的空间转录组测序解码方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）基于寡核苷酸链编码的空间信息编码微球的设计；所使用的微球为表面带有羧基基团的单分散磁性微球，磁珠内核为Fe304，表面包裹有SiO2或聚苯乙烯层；5’端带有氨基基团的通用接头引物与磁珠表面的羧基基团在1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐的催化作用下缩合形成酰胺键，随后通过空间信息编码生成引物与接头引物互补延伸，从而在磁珠表面形成107-9条带有空间信息编码的mRNA捕获引物，其核苷酸序列的序列信息包括：断裂基团、扩增和测序接头序列、空间编码序列、分子标签序列和mRNA捕获探针序列，空间信息编码微球之间的空间编码序列互不相同，单个微球上的带有空间信息编码的mRNA捕获引物上的分子标签序列互不相同；（2）瞬态编码引物的设计与使用；瞬态编码引物设计如下：批次示意序列、瞬态编码序列barcodeA、barcodeB、被捕获序列；具体为：1）批次示意序列，序列固定、已知且对应于瞬态编码引物的批次，用于说明本条瞬态编码引物为进行X轴编码的引物还是进行Y轴编码的引物；2）瞬态编码序列barcodeA1-n、barcodeB1-n，序列已知，使用时按照特定顺序添加，将X1-Xn、Y1-Yn的二维空间位置信息与其序列产生关联；被捕获序列用于被空间信息编码微球表面带有Poly-T的引物捕获；通过90°旋转微孔板，使得微流芯片上的微流通道以先与X向平行后与X向垂直的形式覆盖到微孔板上，微流芯片具有多条微流通道且微流通道在流经微孔板时相互平行，每次微流芯片贴合到微孔板上后，按照特定的顺序（X1-Xn，Y1-Yn）向微流芯片的各加样孔加入各瞬态编码引物，在使用微流芯片分别添加X向、Y向的瞬态编码引物至微孔板对其中微球进行空间位置信息编码后，微孔板中的各磁珠与其二维空间位置信息产生对应关系，分别被标记为（Xa，Yb）；瞬态编码引物的使用方法如下：将空间信息编码磁珠装载于PDMS或PMMA微孔板中，微孔孔直径与孔深度可保证单个微孔中仅填入单个微球；将具有多条微流通道的微流芯片覆盖到微孔板上，按照特定的顺序向微流芯片的各加样孔加入各瞬态编码引物，瞬态编码引物中瞬态编码序列已知，经碱基互补配对，各微孔中的微球捕获到与其二维空间位置信息相对应的瞬态编码引物；所述微孔板制作如下：微孔板为正方形，其边长与微流芯片的宽长度一致；微孔板上微孔的孔直径与孔深度可保证单个微孔在一次装载中仅填入单个微球；所述微流芯片制作如下：微流芯片为长方形，两端分别有与其具有的微流通道数相对应的贯穿芯片的进样口与出样口，一对对应的进样口与出样口通过微流芯片下表面的微流通道相连接；连接一对对应的进样口与出样口的微流通道其微通道高度与微通道宽度相等1-1000μm，微通道间间隔为微通道宽度的一半；（3）组织切片处理及信使RNA的捕获；（4）建库测序及分析定位。

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