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申请/专利权人：天津大学

摘要：本发明公开了一种工程强化希瓦氏菌囊泡分泌提高电能输出的方法，筛选编码细胞外膜、肽聚糖完整性、脂多糖合成以及孔蛋白的基因ompR、wbpP、gmhB、wbpA；针对每个基因设计6个靶向sgRNA，通过Goldengate组装，构建包含sgRNA和dCas9的重组质粒；将重组质粒通过化学转化、接合转移导入希瓦氏菌中，得到24个工程菌株；诱导工程菌系统表达CRISPR‑dCas9，对目的基因的转录抑制从而促进囊泡分泌，通过扫描电子显微镜观察囊泡的数量，筛选出每个基因最高效sgRNA对应的工程菌株；构建基于工程菌株二级发酵液和铁氰化钾溶液的微生物燃料电池，其电能输出效果明显提升。

主权项：1.一种工程强化希瓦氏菌囊泡分泌提高电能输出的方法；其特征是：包括如下步骤：（1）筛选模式产电微生物希瓦氏菌ShewanellaoneidensisMR-1基因组上有利于囊泡分泌的相关基因，得到与细胞外膜或肽聚糖结构完整性相关的基因wbpP；基因wbpP的序列为SEQIDNO.2；（2）针对目的基因wbpP分别设计构建6个靶向sgRNA及其上、下游引物；（3）通过Goldengate技术分别将不同的sgRNA序列整合到具有dCas9蛋白、IPTG诱导型Ptac启动子和卡那抗生素抗性的原始基础质粒pHG11-dCas9上，得到6个包含sgRNA和dCas9的重组质粒；步骤3涉及的原始基础质粒pHG11-dCas9的序列为SEQIDNO.5；（4）将步骤（3）构建的6个重组质粒分别热激化转至2,6-二氨基庚二酸营养缺陷型大肠杆菌感受态WM3064中并抗性筛选；（5）将步骤（4）抗性筛选得到的含有重组质粒的大肠杆菌WM3064与所述野生希瓦氏菌MR-1进行接合转移，将大肠杆菌中的重组质粒导入所述野生希瓦氏菌MR-1中构建6株工程希瓦氏菌株；（6）诱导步骤（5）构建的6株工程希瓦氏菌株CRISPR-dCas9系统的表达，对每个目的基因进行转录抑制，并通过扫描电子显微镜观察囊泡的数量，筛选出目的基因的最高效sgRNA对应的工程菌株；所述工程菌株含有的重组质粒序列为SEQIDNO.7；（7）基于步骤（6）筛选得到的工程菌株的二级发酵液和铁氰化钾溶液，分别构建双室微生物燃料电池并进行电化学表征，通过诱导CRISPR-dCas9系统表达，对靶基因的转录抑制从而促进囊泡分泌，提高其胞外电子传递能力。

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百度查询： 天津大学 一种工程强化希瓦氏菌囊泡分泌提高电能输出的方法