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申请/专利权人：陕西青美生物科技有限公司

摘要：本发明涉及林业育苗生产领域，公开了一种山桐子细胞悬浮培养育苗方法，包括以下步骤：山桐子嫩茎表面用1%的次氯酸钠溶液进行消毒处理，再把嫩茎置于70%浓度的乙醇酒精中浸泡；用刀片将步骤2中处理好的山桐子嫩茎切碎成小块；置于1.2%的CellulaseR‑10酶溶液中，置于恒温培养箱中孵育；使用细胞孔径滤纸，将处理后的样品过滤，以去除残余的山桐子细胞壁碎片，使用清洁的缓冲液进行多次洗涤，以至使单细胞原生质体干净，等等。本发明中，有效地支持了山桐子细胞的分离和培养，改善传统的繁殖山桐子的方法往往繁育时间长、成活率低的问题，促进细胞分裂和生长，紫外灯杀菌则确保了培养环境的无菌性，减少外源性污染。

主权项：1.一种山桐子细胞悬浮培养育苗方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1、取山桐子的嫩茎，同时准备好所需的培养基和消毒器具；步骤2、山桐子嫩茎表面用1%的次氯酸钠溶液进行消毒处理，再把嫩茎置于70%浓度的乙醇酒精中浸泡；步骤3、用刀片将步骤2中处理好的山桐子嫩茎切碎成小块；步骤4、将步骤3处理好的小块，置于1.2%的CellulaseR-10酶溶液中，置于恒温培养箱中孵育；步骤5、再将山桐子的组织置于含有1.2%的PectolyaseY-23酶解液中，将含有酶解液和组织的容器置于恒温培养箱中进行孵育，然后再加入消化酶抑制剂再次放入水浴锅里加热一段时间；步骤6、使用细胞孔径滤纸，将处理后的样品过滤，以去除残余的山桐子细胞壁碎片，使用清洁的缓冲液进行多次洗涤，以至使单细胞原生质体干净；步骤7、经过酶解孵育后，观察组织的变化，组织分离并释放出单个细胞后，将分离的单个细胞转移到新的MS+0.2mgLIAA液体培养基中，培养出山桐子细胞液；步骤8、在无菌条件下，将上一步骤得到山桐子细胞培养基置于摇床上，保持一定转速培养，每天光照一段时间进行培养；步骤9、制作固体培养基MS+琼脂+1.5mgLIAA+0.1mgLIBA，调节培养基的pH值为酸性，将配置好的培养基倒入培养皿，立刻盖上培养皿盖子，等培养皿里培养基凝固后，放到超净工作台中用紫外灯杀菌；步骤10、将步骤7培养的山桐子细胞液在超净工作台里面均匀的涂在配置好的培养皿里面，在光照下培养；步骤11、给无糖组培盒子提前铺上蛭石，并浇灌好生根溶液，再将培养皿中培养的嫩苗移栽至无糖培养盒里面，盖上盒子，每天光照培养，盒子须强制换气，二氧化碳浓度保持在1000-1500pmolL，一段时间后长成山桐子组培苗。

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